PEG修飾的大黃酸偶聯(lián)物的合成及紫杉醇納米膠束的制備

王夏英，邱梁楨，李青卓，徐 偉，王曉穎

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122)

聚合物膠束作為一種納米藥物載體，近年來受到廣泛的關(guān)注。聚合物膠束的疏水內(nèi)核可作為疏水性藥物的存儲空間，將難溶性藥物包載于其中；其親水性外殼能提高膠束在水溶液中的穩(wěn)定性，并能保護(hù)膠束，避免其在體內(nèi)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別而被快速清除[1-3]。聚合物膠束粒徑較小，能通過增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)(EPR)提高抗腫瘤藥物向腫瘤部位遞送的效果[4-5]。

羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)為殼聚糖水溶性衍生物，具有良好的生物相容性，生物活性，抗菌活性及穩(wěn)定性。CMCS上具有多種官能團(tuán)，例如-NH2和-COOH，具有良好的可修飾性。因此，CMCS作為藥物載體被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[6-7]。大黃酸(rhein，R)為中藥大黃的主要成分之一，具有抗炎、抗腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤血管生成等作用[8-9]，并與抗腫瘤藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)具有協(xié)同抗腫瘤作用[10]。

聚乙二醇(PEG)由重復(fù)的氧乙烯基組成，其具有高度的親水性。研究人員于上世紀(jì)70年代首次提出將PEG用于藥物的修飾[11]。經(jīng)PEG化的藥物能增加水溶性，降低酶降解和腎小球?yàn)V過率，下調(diào)免疫原性或抗原性，保護(hù)其免遭體內(nèi)環(huán)境破壞[12-15]。目前，許多PEG化的化療制劑已被FDA批準(zhǔn)上市[16-18]。

本研究以PEG修飾的羧甲基殼聚糖為骨架，接枝小分子大黃酸合成兩親性mPEG-羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物(CRmP偶聯(lián)物)作為藥物遞送載體材料，并制備了載抗腫瘤藥物PTX的CRmP納米膠束(PTX/CRmP納米膠束)，該膠束能增加PTX的水溶性，并提高PTX抗腫瘤的效果。

1 材 料

1.1 試 劑

O-羧甲基殼聚糖(相對分子質(zhì)量1×105，青島弘海生物技術(shù)有限公司)；大黃酸(陜西澳源生物技術(shù)有限公司，純度≥98%)；紫杉醇(上海中西三維藥業(yè)有限公司)；透析袋(MWCO14000，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，純度≥98%)；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，純度≥98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；羧基化聚乙二醇單甲醚(mPEG-COOH，相對分子質(zhì)量2 000，純度≥98%，上海金穗生物科技有限公司)；RPMI Medium Modified，磷酸鹽緩沖液(1×)，0.25%胰蛋白酶(1×)，青霉素鏈霉素溶液(美國HyClone公司)。

1.2 儀 器

MS105DU十萬分之一電子天平[特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Alpha1-2 LD冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司)；NICOMPTM380ZLS激光粒徑測定儀(美國Santa Bbarbara公司)；Avance III 500核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；原子力顯微鏡5500(美國Agilent公司)；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

2 方 法

2.1 PEG修飾的羧甲基殼聚糖-大黃酸(CRmP)偶聯(lián)物的合成

稱取適量的CMCS置反應(yīng)瓶中，加入蒸餾水10 mL溶脹30 min。取反應(yīng)量的大黃酸置廣口瓶中，加入1%NaHCO3溶液10 mL，加熱使溶解，冷卻至室溫。取反應(yīng)量的mPEG-COOH粉末置廣口瓶中，加入蒸餾水5 mL溶解。將mPEG-COOH溶液加入到已冷卻至室溫的大黃酸溶液中，加入EDC·HCl，活化20 min，再加入NHS，將此混合液攪拌下加入CMCS溶液中，避光攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮沉淀反應(yīng)物，靜置后抽濾(0.45 μm的濾膜)。將抽干后的反應(yīng)產(chǎn)物溶解于水中，冰水浴條件下探頭超聲至澄清后過0.8 μm的濾膜，濾液轉(zhuǎn)置于透析袋中透析3 d。

透析結(jié)束后，將產(chǎn)物水溶液再次在冰水浴條件下探頭超聲20 min后，取上清液過膜(0.8 μm)，濾液-20 ℃冰箱預(yù)凍，冷凍干燥，即得CRmP偶聯(lián)物。

2.2 CRmP偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紅外光譜(FT-IR)表征 采用溴化鉀(KBr)壓片法。取適量CMCS、大黃酸、mPEG-COOH、CRmP偶聯(lián)物，分別加適量KBr，于紅外燈下研磨混合，壓片，進(jìn)行紅外檢測，記錄FT-IR光譜。

2.2.2 核磁共振氫譜(1H NMR)表征 分別稱取CMCS、mPEG-COOH和CRmP偶聯(lián)物各10 mg，CMCS、mPEG-COOH以D2O為溶劑，CRmP偶聯(lián)物以D2O-DMSOd6，1∶1比例為溶劑，溶解后加入核磁管中，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，采用核磁共振儀測定樣品的1H NMR。

2.3 取代度的測定

2.3.1 大黃酸取代度的測定 CRmP偶聯(lián)物上大黃酸的取代度采用紫外分光光度法測定。精密稱取大黃酸對照品適量，以甲醇為溶劑配制系列濃度，于229 nm波長處檢測，繪制大黃酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供試品溶液所測的吸收度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到大黃酸的濃度，根據(jù)公式(1)計(jì)算大黃酸在CRmP偶聯(lián)物上的取代度(DSR)：

(1)

式中，mR為大黃酸接枝在CRmP偶聯(lián)物上的量(g)；mCRmP為測定時(shí)所稱取的CRmP偶聯(lián)物的量(g)。

2.3.2 mPEG-COOH取代度的測定 mPEG-COOH取代度通過1H NMR譜計(jì)算而得。CRmP偶聯(lián)物完成1H NMR譜圖分析后，根據(jù)特征峰峰面積的比值計(jì)算得到mPEG-COOH的取代度。

2.4 PTX/CRmP納米膠束的制備

稱取CRmP偶聯(lián)物18 mg，加蒸餾水適量，室溫下攪拌溶解后冰水浴探頭超聲10 min，將PTX溶于無水乙醇中，然后逐滴加至CRmP納米膠束溶液中，劇烈攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，透析24 h后，冰水浴探頭超聲20 min后用0.8 μm濾膜濾過，即得PTX/CRmP納米膠束溶液，凍干后得PTX/CRmP納米膠束凍干粉末。

2.5 PTX/CRmP納米膠束載藥量和包封率的測定

2.5.1 色譜條件的建立 色譜柱為Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(69∶31)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為227 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取PTX 3 mg，精密稱定，置10 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為307 μg/mL的儲備液。取此儲備液，以甲醇為溶劑，逐步稀釋配制質(zhì)量濃度分別為92.1,61.4、30.7,24.56,15.35,2.456,1.535 μg/mL的PTX溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，

2.5.3 測定方法 精密稱定適量的PTX/CRmP納米膠束凍干粉末，加水溶解，0.8 μm濾膜濾過。取適量的濾過液置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，破壞膠束結(jié)構(gòu)，使得PTX從膠束中游離出來溶解在甲醇溶液中，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算PTX含量，并計(jì)算該納米膠束的包封率(EE)和載藥量(DL)。

2.6 PTX/CRmP納米膠束的表征

2.6.1 PTX/CRmP納米膠束的粒徑分布與電位 稱取適量PTX/CRmP納米膠束凍干粉末，冰浴探頭超聲溶解，過0.8 μm濾膜，制備得到PTX/CRmP納米膠束溶液，用動態(tài)激光粒徑儀(DLS)測定膠束粒徑分布及Zeta電位。

2.6.2 PTX/CRmP納米膠束的形態(tài)學(xué)分析 PTX/CRmP納米膠束的形貌研究采用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)觀察。新剝離的云母片預(yù)先用雙面膠貼在金屬基片上，吸取載藥PTX/CRmP納米膠束溶液適量，滴加到云母表面上，用氮吹儀使其干燥完全。待云母片上的溶液干燥形成薄膜后，將云母片置AFM中進(jìn)行觀察進(jìn)行掃描觀察，顯微鏡探頭采用輕敲模式(tapping mode)探測膠束形貌。

2.7 PTX/CRmP納米膠束的體外細(xì)胞毒性

PTX/CRmP納米膠束的體外細(xì)胞毒性通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法評價(jià)。

2.7.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞(ATCC)加入含有10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)到約為80%～90%，細(xì)胞單層貼壁生長時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.7.2 細(xì)胞種板 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按常規(guī)方法消化細(xì)胞制備單細(xì)胞混懸液，將細(xì)胞混懸液以1 200 r/min離心3 min，棄除上清液，加入新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為每毫升5×104個細(xì)胞的懸浮液，接種于96孔板中，每個孔加入細(xì)胞懸浮液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育24 h使其貼壁。

2.7.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 待細(xì)胞孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液。設(shè)置不同分組，包括Taxol?組、Cremophor EL:無水乙醇混合溶劑(1∶1)組、CRmP偶聯(lián)物組、PTX/CRmP納米膠束組、空白組和對照組。將上述各組受試液向96孔板中各加入150 μL，分別含PTX濃度為1 000,500,100,50,10,5,1 nmol/L 6種不同濃度的培養(yǎng)液，每個濃度平行6個孔，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基和MTT溶液為空白組，含細(xì)胞不給藥物的細(xì)胞為正常組，37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。分別于加藥后24,48,72 h，將培養(yǎng)板取出，每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后取出，小心吸取上清液。每孔加入DMSO150 μL溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物。用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收度。并根據(jù)各孔的吸收度計(jì)算細(xì)胞的存活率。

3 結(jié) 果

3.1 CRmP偶聯(lián)物的合成

CMCS分子鏈上有豐富的氨基，大黃酸、mPEG-COOH結(jié)構(gòu)上含有羧基。因此，本反應(yīng)以活性較高的酰胺反應(yīng)為基礎(chǔ)，在EDC和NHS的催化下，同時(shí)活化大黃酸和mPEG-COOH的羧基，使其與CMCS的氨基發(fā)生酰胺反應(yīng)，將大黃酸、mPEG-COOH接枝到CMCS上形成CRmP偶聯(lián)物。該合成工藝(見圖1)簡單，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率較高，操作簡便易于重復(fù)。

Figure1 Synthesis of CRmP conjugate

CMCS:Carboxymethyl chitosan;CRmP：PEGylated carboxymethyl chitosan-rhein

3.2 FT-IR圖譜解析

圖2-d為mPEG-COOH的FT-IR譜圖，可以觀察到3 455 cm-1處的-OH的伸縮振動峰，2 889 cm-1處的-C-H的伸縮振動峰，1 742 cm-1處的C=O的伸縮振動峰，以及1 115 cm-1處的-C-O-C-鍵的伸縮振動峰。圖2-c為大黃酸的FT-IR譜圖。3 061 cm-1，1 693 cm-1為-COOH的振動峰。圖2-b為CMCS的FT-IR譜圖，3 423 cm-1處是-NH和-OH的伸縮振動峰，2 922 cm-1處吸收峰為-CH的伸縮振動峰，1 594 cm-1處為羧基上的-C=O伸縮振動吸收峰，1 410 cm-1處峰為-OH和-CH的環(huán)變形振動吸收峰，1 067 cm-1處峰為-C-O伸縮振動吸收峰。圖2-a為CRmP偶聯(lián)物的FT-IR譜圖，與CMCS譜圖相比，3 455 cm-1處-NH和-OH的伸縮振動吸收峰變窄，這是由于CMCS主鏈上的氨基接枝mPEG-COOH和大黃酸的影響結(jié)果，2 881 cm-1處為mPEG-COOH的重復(fù)單元(-CH2-CH2-O-)中的-C-H的伸縮振動峰，此處的伸縮振動峰變強(qiáng)，表明接上mPEG-COOH后引入更多的碳?xì)滏I，1 208 cm-1處-C-O-C-鍵的伸縮振動峰，這些是mPEG主結(jié)構(gòu)的特征吸收峰；與mPEG-COOH紅外吸收峰相比較，結(jié)合物在1 742 cm-1處羰基的伸縮振動峰消失。1 629 cm-1、1 569 cm-1處出現(xiàn)酰胺鍵Ⅰ,Ⅱ譜帶，說明mPEG-COOH、大黃酸上的羰基轉(zhuǎn)變成為酰胺鍵上的羰基。

3.3 1H NMR圖譜解析

mPEG-COOH、大黃酸、CMCS和CRmP偶聯(lián)物的1H NMR圖譜如圖3所示。圖3-c為CMCS的1H NMR 圖譜，δ4.7為溶劑(D2O)峰，δ2.00殼聚糖上脫乙酰度不完全的乙酰氨基(-NHCOH3)的質(zhì)子峰，δ3.55～3.85是殼聚糖糖環(huán)上的質(zhì)子峰(H-3，H-4，H-5，H-6)，δ3.03為CMCS糖環(huán)上C2-H質(zhì)子峰。圖3-a為mPEG-COOH核磁氫譜圖，δ4.68為溶劑(D2O)峰，δ3.34為mPEG-COOH末端甲氧基(-OCH3)質(zhì)子峰，δ3.5～3.7為mPEG-COOH重復(fù)單元(-CH2-CH2-O-)。與圖3-a、c相比較，圖3-d CRmP偶聯(lián)物1H NMR圖中δ3.47～3.87處出現(xiàn)了將強(qiáng)的峰，此為mPEG-COOH上的重復(fù)單元-OCH2CH2的質(zhì)子峰，此外在δ3.34出現(xiàn)了mPEG-COOH甲氧基-OCH3質(zhì)子峰，除了mPEG-COOH峰外，在δ8.12、7.84、7.75、7.73、7.41(圖3中放大部分)處出現(xiàn)了大黃酸結(jié)構(gòu)上(-CH，-OH)的質(zhì)子信號峰，此為大黃酸的特征信號峰，由此推斷CRmP偶聯(lián)物已成功合成。

Figure2 FT-IR spectra of CRmP conjugate (a),CMCS (b),rhein (c),mPEG-COOH (d)

Figure31H NMR spectra of mPEG-COOH (a),CMCS (C) in D2O,and rhein (b) in DMSO，and CRmP conjugate (d) in D2O/DMSO cosolvent (1∶1)

3.4 取代度分析

通過紫外分光光度法測得大黃酸的取代度為7.6%。從CRmP的1H NMR譜圖中可以看出，δ3.03處CMCS糖環(huán)上C2-H的質(zhì)子峰與δ3.34處mPEG-COOH末端甲氧基(-OCH3)的質(zhì)子峰易于分辨，故采用δ3.03 與δ3.34的峰面積的比值計(jì)算得到mPEG的取代度為36%。

3.5 PTX/CRmP納米膠束的形態(tài)分析

經(jīng)測定，PTX/CRmP納米膠束的平均粒徑為(204.1±10.7)nm(圖略)，PDI為(0.13±0.01)，Zeta電位為(-30.21±3.69)mV。AFM圖(圖4)中可見PTX/CRmP納米膠束形態(tài)均一，近似球形，粒徑在200 nm左右，與DLS測定的膠束粒徑結(jié)果相一致。

Figure4 AFM images of PTX/CRmP at the mode of 2D(A)and 3D(B)

PTX：Paclitaxel

3.6 PTX/CRmP納米膠束載藥量與包封率

PTX質(zhì)量濃度在1.00～90.0 μg/mL內(nèi)，其線性關(guān)系良好。線性回歸方程為A=35 855c-43 558，其相關(guān)系數(shù)為r=0.999 7。分別選取3組制備得到的PTX/CRmP納米膠束，分別測定PTX的載藥量和包封率。PTX/CRmP納米膠束載藥量為(38.24±2.78)%，包封率為(79.85±7.32)%。

3.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

通過MTT法分別考察Taxol?的溶劑Cremophor EL-無水乙醇混合溶劑(1∶1)和載體材料CRmP偶聯(lián)物對MCF-7細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果(圖5)顯示，對于空白載體材料，MCF-7細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h后，載體材料CRmP偶聯(lián)物具有良好的安全性，即使孵育濃度為1 mmol/L時(shí)，對細(xì)胞的存活率也并無顯著影響，細(xì)胞存活率均在95%以上。對于PTX制劑，Taxol?及PTX/CRmP納米膠束均對MCF-7細(xì)胞有一定的抑制率。在藥物作用24、48、72 h時(shí)，Taxol?及PTX/CRmP納米膠束對MCF-7細(xì)胞的抑制作用均隨著PTX濃度的增加，表明Taxol?及PTX/CRmP納米膠束對MCF-7細(xì)胞均有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。

PTX市售注射劑Taxol?與PTX/CRmP納米膠束均顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。Taxol?與PTX/CRmP納米膠束24 和48 h孵育濃度小于5 nmol/L時(shí)，沒有顯著的細(xì)胞毒性，而PTX/CRmP納米膠束在72 h孵育濃度為5 nmol/L時(shí)表現(xiàn)出了顯著的細(xì)胞毒性，說明PTX/CRmP納米膠束在低濃度并長時(shí)間給藥后顯示出優(yōu)于Taxol?對MCF-7細(xì)胞的殺傷作用。表1中，Taxol?與PTX/CRmP納米膠束對MCF-7的IC50數(shù)據(jù)中可以看出，隨作用時(shí)間延長，PTX/CRmP納米膠束顯示出比Taxol?更好的細(xì)胞殺傷效果。

Figure5Invitrocytotoxicity of CRmP conjugate and PTX/CRmP against MCF-7 cells

Blank vehicle:Cremophor EL:ethanol (1∶1)

*P<0.05,**P<0.01

Table1 IC50values of Taxol?and PTX/CRmP against MCF-7 cells

4 討 論

在本研究中，通過PEG修飾CMCS并接枝大黃酸成功合成CRmP偶聯(lián)物，高分子CMCS和PEG具有親水性，小分子大黃酸為疏水性，因此，該偶聯(lián)物具有兩親性，能夠在水中自組裝成聚合物膠束。PTX為疏水性藥物，能夠被包載于CRmP膠束的疏水內(nèi)核中，形成載PTX的納米膠束。CRmP作為PTX的遞送載體，既增強(qiáng)了PTX的水溶性，同時(shí)可避免PTX直接與正常組織細(xì)胞接觸而產(chǎn)生的毒副作用。

PTX/CRmP納米膠束具有出色載藥能力，載藥量達(dá)38%；并且粒徑較小，粒徑分布均勻，能夠有效避免載藥膠束被體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而清除，也能更多地通過EPR效應(yīng)遞送藥物到達(dá)腫瘤部位[19]；載藥膠束呈電負(fù)性，避免了對人體正常組織細(xì)胞的殺傷作用；PEG修飾后，可以降低膠束在體內(nèi)遞送藥物過程中與蛋白質(zhì)的結(jié)合率[20]，避免在體內(nèi)被快速清除。實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果表明PTX/CRmP納米膠束具體對PTX具有較好的負(fù)載和遞送能力，相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。

MTT法細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)證明了CRmP偶聯(lián)物具有極低的細(xì)胞毒性，因此，其可以作為安全的載體材料應(yīng)用于水難溶性藥物的遞送。PTX/CRmP納米膠束在MCF-7細(xì)胞系體現(xiàn)出的時(shí)間依賴性的體外細(xì)胞毒性，表明PTX/CRmP納米膠束由于載體材料的包載，在短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞毒性作用并未體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，但能夠隨時(shí)間推移而呈現(xiàn)較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，其對腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制是否與載體材料上的小分子大黃酸的抗腫瘤作用相關(guān)，有待深入研究。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究所合成的CRmP偶聯(lián)物具有較好的納米載體特征，所制備的PTX/CRmP納米膠束預(yù)期能夠?qū)TX起到很好的體內(nèi)遞送作用，其將在通過EPR效應(yīng)的被動靶向腫瘤給藥方向具有良好的應(yīng)用前景。