玉米紫色植株色素預(yù)干預(yù)對過氧化氫致成骨細(xì)胞氧化損傷的影響

張卓，周波，郭連瑩，王曉紅，于葉，張書婉

（沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034）

近年研究顯示，環(huán)境因素、某些生理及病理狀態(tài)均可引起骨組織代謝異常，從而影響由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同參與的骨重建過程，最終導(dǎo)致骨代謝紊亂［1-2］。氧化應(yīng)激已成為多種慢性骨代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制之一［1］。自然界中，天然抗氧化物種類繁多［3-4］，理論上來講，適量攝入抗氧化劑在維持機體骨健康方面的作用是積極的。有研究證實，抗氧化活性物質(zhì)在骨代謝疾病的防治過程中起到了一定的保護性作用［5-6］。

玉米紫色植株色素（maize purple plant pigment，MPPP）源于新品種玉米的紫色植株，其主要成分的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示，MPPP是花色苷類色素，總色素含量達(dá)90%以上，兩種主要成分分別為矢車菊素-3-葡萄糖苷和3′，4′-二羥基花色素-3-葡萄糖苷［7］。研究發(fā)現(xiàn)，MPPP具有較強的抗氧化活性［8-9］和促進成骨細(xì)胞增殖的能力［10］。本研究以MC3T3-E1成骨細(xì)胞為體外干預(yù)模型，用過氧化氫（H2O2）制備氧化損傷模型，觀察MPPP預(yù)干預(yù)條件下成骨細(xì)胞的抗氧化損傷作用，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 MPPP（遼寧省東亞種業(yè)有限公司）；H2O2（美國Sigma公司）；改良型α-MEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司）；胎牛血清（FBS）（天津灝洋生物制品科技有限公司）；MTT溶液（美國Sigma公司）；總抗氧化能力測試盒（T-AOC）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）。

1.2 儀器與設(shè)備 BB-15型CO2培養(yǎng)箱（美國Heraeus公司）；Sonics超聲波破碎儀（美國Sonics&Materials公司）；SpectraMax Plus 384全光譜掃描儀（美國MD公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。將MC3T3-E1成骨細(xì)胞復(fù)蘇后，置于改良型α-MEM培養(yǎng)基（含10%FBS）中，于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。

1.3.2 主要溶液配制 取0.5 g MPPP、0.1 ml H2O2分別溶解于10 ml含2%FBS的改良型α-MEM培養(yǎng)液中，過濾除菌，儲備液濃度均為10-1mol/L。參考前期實驗結(jié)果，將MPPP用相同培養(yǎng)液等倍稀釋至 10-7、10-6及 10-5mol/L［10］；H2O2等倍稀釋至10-10～10-3mol/L。上述溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 成骨細(xì)胞氧化損傷模型的建立 調(diào)整細(xì)胞密度，接種于96孔板（每孔150μl），共設(shè)9組，每組8個復(fù)孔。48 h后，更換培養(yǎng)液150μl（含2%FBS），同步化24 h后，吸棄培養(yǎng)液，更換150 μl H2O2濃度分別為0 mol/L和10-10～10-3mol/L的培養(yǎng)液（含2%FBS），1 h后PBS清洗，向各孔中加入20μl MTT溶液（5 mg/ml），4 h后每孔更換150 μl二甲基亞砜（DMSO），37℃混勻10 min后，酶標(biāo)儀490 nm檢測光密度（OD）值，確定H2O2氧化損傷細(xì)胞的最佳濃度為5×10-4mol/L。

1.3.4 H2O2對MPPP預(yù)干預(yù)成骨細(xì)胞的影響 調(diào)整細(xì)胞密度，接種于96孔板（每孔150μl），共設(shè)3個批次，每個批次共5組，每組8個復(fù)孔，分組及處理因素如下：對照組、H2O2處理組（H2O2：5×10-4mol/L）、低濃度 MPPP組（MPPP：10-7mol/L+H2O2：5×10-4mol/L）、中濃度MPPP組（MPPP：10-6mol/L+H2O2：5×10-4mol/L）和高濃度 MPPP 組（MPPP：10-5mol/L+H2O2：5×10-4mol/L）。48 h后，每個批次中的對照組和H2O2處理組均更換150 μl培養(yǎng)液（含2%FBS），低、中、高濃度MPPP組分別更換MPPP濃度為10-7、10-6及10-5mol/L的培養(yǎng)液150μl（含2%FBS），3個批次分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h及72 h。每個批次于實驗結(jié)束前5 h，吸棄各孔中培養(yǎng)液，對照組各孔更換培養(yǎng)液（含2%FBS），其余各孔更換濃度為5×10-4mol/L的H2O2液（含2%FBS），1 h后PBS清洗，向各孔中加入MTT溶液20 μl（5 mg/ml），4 h后每孔更換DMSO 150μl，37℃混勻10 min后，酶標(biāo)儀490 nm檢測OD值。

1.3.5 總抗氧化能力（T-AOC）檢測 細(xì)胞消化，調(diào)整密度后接種于24孔板，每孔1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。吸棄培養(yǎng)液，加入含2%FBS培養(yǎng)液同步化24 h后，按照1.3.4中的分組方法添加受試物（MPPP預(yù)干預(yù)72 h），每組4個復(fù)孔，細(xì)胞消化，PBS清洗，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，4℃超聲破碎，低溫高速離心5 min，取上清液，按T-AOC試劑盒說明書進行操作，分別測定各組樣品中蛋白含量和相對T-AOC。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析行差異顯著性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對成骨細(xì)胞增殖的影響 與對照組（0 mol/L）比較，H2O2濃度范圍從10-7mol/L至10-3mol/L的各組細(xì)胞OD值均顯著降低（P＜0.01），其中以10-3mol/L濃度組細(xì)胞OD值最低，見圖1。

2.2 H2O2對MPPP預(yù)干預(yù)的成骨細(xì)胞增殖和TAOC的影響 MPPP預(yù)干預(yù)24 h后，經(jīng)H2O2處理的各組細(xì)胞OD值均顯著低于對照組（P＜0.01），但低、中、高濃度MPPP組OD值與H2O2處理組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。MPPP預(yù)干預(yù)48 h和72 h后，H2O2處理組的OD值均顯著低于對照組（P＜0.05）；預(yù)干預(yù) 72 h后，僅高濃度MPPP組細(xì)胞OD值顯著高于H2O2處理組（P＜0.05）。此外，MPPP預(yù)干預(yù)72 h后，與對照組比較，H2O2處理組和低、中、高濃度MPPP組成骨細(xì)胞T-AOC顯著降低（P＜0.01），且高濃度MPPP組成骨細(xì)胞T-AOC明顯高于H2O2處理組（P＜0.01），見表1。

圖1 H2O2對細(xì)胞增殖的影響（±s，n=8）

表1 H2O2對MPPP預(yù)干預(yù)成骨細(xì)胞增殖能力和T-AOC的影響（±s）

表1 H2O2對MPPP預(yù)干預(yù)成骨細(xì)胞增殖能力和T-AOC的影響（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與 H2O2處理組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

組別對照組H2O2處理組低濃度MPPP組中濃度MPPP組高濃度MPPP組T-AOC（%）（n=4）100．00±5．84 31．21±4．852）36．01±8．162）36．42±15．872）60．78±10．702）4）OD值（n=8）預(yù)干預(yù)24 h 0．129 9±0．016 0 0．108 6±0．007 02）0．109 1±0．023 42）0．108 8±0．010 92）0．099 7±0．012 52）預(yù)干預(yù)48 h 0．126 1±0．015 9 0．110 8±0．010 61）0．113 3±0．010 2 0．116 5±0．013 1 0．115 3±0．012 8預(yù)干預(yù)72 h 0．134 6±0．009 9 0．110 7±0．011 31）0．119 0±0．022 5 0．124 1±0．019 1 0．133 7±0．028 13）

3 討論

骨代謝過程主要由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同完成。在正常生理條件下，骨形成和骨吸收始終保持動態(tài)收支平衡，骨重建維持穩(wěn)態(tài)。一旦受到各種影響因素持續(xù)干擾，骨重建過程即可發(fā)生相對失衡，引發(fā)骨量異常，特別是氧化應(yīng)激狀態(tài)下，成骨細(xì)胞對活性氧極其敏感，其活性可受到明顯抑制，成骨作用減弱，骨量逐漸減少，最終引發(fā)相應(yīng)的骨代謝疾?。?］。體內(nèi)外研究證實，外源性抗氧化劑在清除機體自由基的同時，亦可提升成骨細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活力，從而減弱氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞的氧化損傷［11-12］。

T-AOC水平不僅可以反映組織自由基清除能力，還可以作為反映酶類和非酶類抗氧化系統(tǒng)的一項綜合性指標(biāo)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，MPPP預(yù)干預(yù)條件下，可抑制來自H2O2對成骨細(xì)胞的氧化損傷，并維持較高水平的T-AOC，進而維持細(xì)胞活力，提示，MPPP可通過提升細(xì)胞抗氧化能力預(yù)防成骨細(xì)胞氧化損傷，維持骨健康。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，花色苷可作為誘導(dǎo)物參與調(diào)控Nrf2信號通路［14］。Nrf2作為機體生物氧化應(yīng)激調(diào)控的開關(guān)，處于調(diào)節(jié)抗氧化酶類表達(dá)的中心地位，在花色苷的誘導(dǎo)下，Nrf2游離釋放，進入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件相互作用，促進抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，最終增強組織細(xì)胞的抗氧化能力［15］。只是，MPPP作為多種花色苷成分的復(fù)合物，其提升成骨細(xì)胞抗氧化能力的作用是否與Nrf2有關(guān)，且這種貢獻(xiàn)在抗氧化作用中占有多大比例，尚需進一步探討?？傊?，MPPP預(yù)干預(yù)可抑制H2O2對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的氧化損傷并提升成骨細(xì)胞T-AOC。