高效液相色譜法測定痛風(fēng)定膠囊中落新婦苷的含量

薛嘉盛，曲健源，王婧蕓，毛明清，金銘昭，房麗娜

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生，遼寧 沈陽 110034；2.醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)專業(yè)學(xué)生；3.內(nèi)科學(xué)專業(yè)研究生；4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室）

痛風(fēng)定膠囊由秦艽、黃柏、延胡索、赤芍、川牛膝、澤瀉、車前子、土茯苓8味藥材組成，具有清熱祛濕、活血通絡(luò)定痛的功效。用于濕熱瘀阻所致的痹痛，癥見關(guān)節(jié)紅腫熱痛，伴有發(fā)熱、汗出不解、口渴心煩、小便黃、舌紅苔黃膩、脈滑數(shù)，臨床常用于治療痛風(fēng)發(fā)作［1-3］?！吨袊幍洹?015年版一部規(guī)定，采用高效液相色譜（HPLC）法測定該品種中黃柏、秦艽兩味藥材中有效成分的含量，并采用薄層色譜法對延胡索、赤芍兩味藥材進行鑒別。然而，沒有對土茯苓等其他藥材中的有效成分進行含量控制。落新婦苷為土茯苓中的有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用［4-6］。本研究采用HPLC法測定該品種中土茯苓的有效成分落新婦苷的含量，為完善痛風(fēng)定膠囊的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 材料

1．1 儀器 高效液相色譜儀（日本日立公司），配備二元高壓梯度泵（L-2130）、紫外檢測器（L-2400）、自動進樣器（L-2200）和工作站；Venusil ASB C18色譜柱（250 mm ×4．6 mm，5μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；XSE105型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多集團）；KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Spectra Max190光吸收酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1．2 藥品與試劑 落新婦苷對照品（批號：S0907AS）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度（99．8%，HPLC）。痛風(fēng)定膠囊購自四川升和藥業(yè)股份有限公司（批號：1803102）。甲醇（美國Sigma-Aldrich公司）、甲酸（天津市科歐密化學(xué)試劑有限公司）均為色譜純。水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 采用C18色譜柱（250 mm×4．6 mm，5μm），甲醇 -1%甲酸水（V∶V=38∶62）為流動相，流速 1．0 ml/min，檢測波長 300 nm，柱溫30℃，進樣量10μl。在上述色譜條件下，落新婦苷的理論塔板數(shù)不少于4 000。色譜圖見圖1。

圖1 落新婦苷的HPLC圖

2．2 溶液的制備

2．2．1 對照品溶液的制備 取落新婦苷對照品約10 mg，精密稱定，置于10 ml容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，得濃度為1．003 mg/ml的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0．5 ml，置于10 ml容量瓶，得濃度為5．015μg/ml的對照品溶液。

2．2．2 供試品溶液 取痛風(fēng)定膠囊20粒，取出內(nèi)容物研細，混勻，取內(nèi)容物約0．5 g，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液40 ml，超聲提取20 min（頻率40 kHz，功率75 W），放置至室溫后，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，過濾（0．45 μm微孔濾膜），取續(xù)濾液作為供試品溶液。

表1 回收率試驗結(jié)果

2．3 定量限與檢測限 取對照品溶液適量，用50%甲醇逐步稀釋，按上述色譜條件進樣測定，結(jié)果落新婦苷的定量限為2．5 ng（信噪比S/N=10），檢測限為1 ng（S/N=3）。

2．4 線性與范圍 取落新婦苷對照品溶液，分別進樣 2、6、10、14、16、18、20 μl，將進樣量 X（ng）與峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程為Y=581 2．0X-783 6．1，相關(guān)系數(shù)（R2）＞0．999 9。結(jié)果表明落新婦苷在 10．03～100．3 ng/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2．5 精密度試驗 精密吸取落新婦苷對照品溶液10μl，在2．1項下色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定落新婦苷的峰面積。結(jié)果落新婦苷峰面積的RSD為1．02%，表明儀器的精密度良好。

2．6 重復(fù)性試驗 取痛風(fēng)定膠囊內(nèi)容物粉末6份，每份約 0．5 g，精密稱定，按照 2．2．2 項下制備方法制備供試品溶液，按2．1項下的色譜條件進行測定，計算含量。結(jié)果落新婦苷的含量平均值為0．852 9 mg/g，RSD為1．37%，表明方法的重復(fù)性良好。

2．7 穩(wěn)定性試驗 取痛風(fēng)定膠囊1份，制備供試品溶液后于室溫下分別放置0、2、4、8、12、24 h后按2．1項下的色譜條件進行測定，以落新婦苷峰面積計，RSD為2．48%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．8 回收率試驗 取已知含量的痛風(fēng)定膠囊約0．25 g，共6份，精密稱定，分別加入對照品溶液（含落新婦苷對照品 0．200 6 mg）適量，按 2．2．2 項下方法制備供試品溶液，按2．1項下的色譜條件進行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。落新婦苷的平均加樣回收率為100．3%，RSD為1．68%，表明方法的回收率良好。

2．9 樣品含量測定 取痛風(fēng)定膠囊約0．5 g，共3份，按2．2．2項下方法制備供試品溶液，按2．1項下的色譜條件進行測定，以外標法計算含量，結(jié)果，痛風(fēng)定膠囊中含有落新婦苷0．354 4 mg/粒。

3 討論

3．1 檢測波長的選擇 取落新婦苷對照品溶液進行全波長掃描，在200～600 nm范圍內(nèi)，落新婦苷在300 nm波長下有較大的吸收，因此選擇300 nm作為測定波長。

3．2 色譜條件的選擇 本研究對流動相系統(tǒng)（甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)）進行考察，并考察了甲酸的濃度對落新婦苷色譜峰峰形的影響。結(jié)果甲醇-0．1%甲酸水作為流動相，可以獲得滿意的色譜峰峰形。在該流動相條件下，甲醇與0．1%甲酸水的體積比為37∶63、38∶62、40∶60時，落新婦苷色譜峰均能與其他色譜峰分離。柱溫為30℃時落新婦苷與相鄰色譜峰的分離度比柱溫為35℃時更大，因此，最終選擇甲醇-0．1%甲酸水（38∶62），柱溫30℃為色譜條件。

3．3 供試品溶液制備方法的選擇 采用單因素輪換法，比較了以水、50%甲醇、90%甲醇作為溶劑，超聲10 min、20 min、30 min提取痛風(fēng)定膠囊中落新婦苷的方法，結(jié)果50%甲醇，超聲提取20 min和30 min時，提取效率最高。最終選擇以50%甲醇作為溶劑，超聲提取20 min作為供試品制備方法。

綜上所述，本研究所建立的HPLC方法操作簡單，線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率良好，能準確測定痛風(fēng)定膠囊總落新婦苷的含量，可作為控制該產(chǎn)品質(zhì)量的方法。由于痛風(fēng)定膠囊是保密配方，無法獲得其處方組成和生產(chǎn)工藝，導(dǎo)致無法制備陰性樣品，因此無法進行專屬性研究。