恩施地區(qū)臘腸的細(xì)菌多樣性

鄧 風(fēng)，王玉榮，尚雪嬌，折米娜，葛東穎，趙慧君，郭 壯,2,*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 恩施 445000）

中式臘腸起源于南北朝前期，是一種外形美觀、味道鮮醇、營(yíng)養(yǎng)豐富的傳統(tǒng)風(fēng)味肉制品[1]。傳統(tǒng)中式臘腸多采用自然發(fā)酵的方式制作，而被稱為“世界硒都”的恩施土家苗族自治州境內(nèi)以山地為主體，少數(shù)民族文化多樣，較好地保留了這種傳統(tǒng)臘腸制作工藝[2]。恩施地區(qū)生產(chǎn)的臘腸以豬肉為原料，添加食鹽、白酒、八角茴香和花椒等輔料，用松柏木熏制或自然晾曬而成。由于制作環(huán)境相對(duì)開放，臘腸樣品中含有豐富的微生物群系。劉長(zhǎng)建等[3]從臘腸中分離出35 株具有降膽固醇能力的乳酸菌，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）清除膽固醇的效率最高。謝科等[4]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從廣式臘腸中分離出4 株葡萄球菌（Staphylococcus），使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）為其中主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。Wang Xinhui等[5]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)中式干臘腸、中式熏臘腸和香腸中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中式干臘腸、中式熏臘腸中的細(xì)菌分布比香腸更為豐富。然而，目前多數(shù)研究主要圍繞廣式臘腸展開，有關(guān)恩施地區(qū)臘腸微生物多樣性的研究仍較少。

大量研究表明，紅曲菌[6]、戊糖乳桿菌[7-8]和葡萄球菌[9-10]對(duì)臘腸品質(zhì)的形成具有明顯影響，因而廣泛開展微生物多樣性的解析對(duì)臘腸品質(zhì)的提升具有積極意義。PCR-DGGE[11]和MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)[12]是在發(fā)酵食品微生物多樣性解析中運(yùn)用較多的2 項(xiàng)技術(shù)，其中PCR-DGGE具有操作簡(jiǎn)單易行、靈敏度高和可檢測(cè)到1 個(gè)核苷酸水平差異的特點(diǎn)[13]，而MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多樣本間微生物多樣性的平行比較，具有通量高的優(yōu)點(diǎn)[14]，目前將2 項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合在窖泥[15]、泡菜[16]和豆豉[17]等發(fā)酵食品微生物多樣性解析中得到了廣泛應(yīng)用。

本研究采用PCR-DGGE與MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)采集自恩施市的臘腸樣品的細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，在明確微生物群落結(jié)構(gòu)構(gòu)成的基礎(chǔ)上，為該地區(qū)后續(xù)臘腸品質(zhì)的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚丙烯酰胺、冰醋酸、飽和酚、尿素、過硫酸銨、四甲基乙二胺、硝酸銀、甲醛、乙二胺四乙酸二鈉、N,N-亞甲基二丙烯酰胺和氯仿 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；QIAGEN DNeasy Mericon Food Kit提取試劑盒德國Qiagen公司；Axygen清潔試劑盒 北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；SolutionⅠ、6×Loading Buffer、DNA聚合酶、dNTP mix、pMD18-T Vector和10×PCR Buffer 寶生物工程（大連）有限公司；引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

HBM-400B拍擊式無菌均質(zhì)器 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；DCodeTMSystem 美國Bio-Rad公司；VeritiTM96 孔梯度PCR擴(kuò)增儀 美國AB公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) 美國Nano Drop公司；Bio-5000 plus掃描儀 上海中晶科技有限公司；MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái) 美國Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器美國Dell公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

分別從湖北省恩施市土橋壩和舞陽壩體育場(chǎng)菜市場(chǎng)（（109.47 °N，30.3 °E））采集臘腸樣品5 種，編號(hào)為L(zhǎng)C1～LC5。采集的臘腸樣品應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1）臘腸使用豬肉制作而成；2）臘腸無肉眼可見雜質(zhì)、無霉變且無異味；3）臘腸的制作地需在恩施市行政區(qū)域內(nèi)。

1.3.2 樣品預(yù)處理及微生物宏基因組DNA提取

將臘腸切碎后，取10 g加入90 mL生理鹽水，使用拍擊器拍擊3 min后，300 r/min條件下離心10 min取上清，上清液10 000 r/min條件下離心10 min后取沉淀，使用QIAGEN DNeasy Mericon Food Kit進(jìn)行微生物宏基因組DNA提取。

1.3.3 基于DGGE技術(shù)的臘腸細(xì)菌多樣性評(píng)價(jià)

用滅菌雙蒸水將各樣品宏基因組DNA的質(zhì)量濃度調(diào)至30 ng/μL，用于后續(xù)擴(kuò)增PCR的擴(kuò)增體系為25 μL，正向和反向引物分別為L(zhǎng)acF-GC-V3F（5’-CG CCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCAC CGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和Lac-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。擴(kuò)增條件和程序：參照文獻(xiàn)[18-19]中的方法，對(duì)16S rRNA的V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳（2 000 bp的Maker為參照，電壓120 V，恒壓時(shí)間30 min）檢測(cè)是否擴(kuò)增出單一、明亮的目的條帶[20]。

使用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性范圍為35%～52%，將0.5×TAE緩沖溶液的溫度調(diào)至60 ℃，每個(gè)膠孔加入10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，120 V預(yù)電泳78 min，然后80 V固定電壓下電泳13 h。電泳結(jié)束后的凝膠采用銀染法顯色，并置于掃描儀上成像[21]。用無菌手術(shù)刀回收優(yōu)勢(shì)條帶，加無菌超純水過夜，取回溶溶液2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增使用不帶GC夾子的正反引物各0.5 μL以及12.5 μL 2×PCR mix，用無菌超純水補(bǔ)齊至20 μL[21]，擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[18-19]中的方法。將重新擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用清潔試劑盒清潔后連接至PMD18-T載體上，然后導(dǎo)入大腸桿菌Top10，將篩選出的陽性克隆送至測(cè)序公司測(cè)序[22]。

1.3.4 基于MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)的臘腸細(xì)菌多樣性評(píng)價(jià)

對(duì)樣品微生物宏基因組16S rRNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGT-3’），擴(kuò)增時(shí)在引物的5’端加上核酸標(biāo)簽[23]，擴(kuò)增體系和條件參照蔡麗云等[24]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)合格后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumian MiSeq PE300。

將測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至R920機(jī)架式服務(wù)器端，利用QIIME分析平臺(tái)[25-26]進(jìn)行序列分析。原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量序列后采用兩步Uclust法[27]在97%的相似度下劃分分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）；從每個(gè)OTU中挑選代表性序列與RDP（ribosomal database project，Release 11.5）[28]和Greengenes（Release 13.8）[29]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)后，使用FastTree軟件[30]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并計(jì)算α多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)手段對(duì)微生物各分類地位的種類、數(shù)量、相對(duì)含量及α多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算；序列長(zhǎng)度分布圖、OTU出現(xiàn)頻率和包含序列數(shù)統(tǒng)計(jì)圖以及臘腸中優(yōu)勢(shì)核心OTU相對(duì)含量的比較分析圖用Origin 2017軟件繪制；臘腸中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門屬相對(duì)含量的比較分析圖和臘腸中優(yōu)勢(shì)核心OTU相對(duì)含量的比較分析圖用Excel 2016軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于DGGE技術(shù)的臘腸細(xì)菌多樣性

圖 1 臘腸中細(xì)菌的DGGE圖譜Fig. 1 DGGE fi ngerprint of bacteria in sausage samples

由圖1可知，條帶6和條帶7的亮度遠(yuǎn)高于其他5 個(gè)條帶且在每個(gè)樣品中均存在，說明條帶6和條帶7所代表的細(xì)菌可能為臘腸樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬。條帶1～5亮度偏暗，且其僅在某幾個(gè)臘腸樣品中存在，說明這些條帶代表的菌屬在臘腸中的含量偏低，且可能僅存在于部分樣品中。樣品LC1的條帶數(shù)最多，而樣品LC5最少，說明樣品LC1的細(xì)菌多樣性最高，樣品LC5最低。

表 1 細(xì)菌DGGE條帶測(cè)序結(jié)果Table 1 Sequencing of bacterial DGGE bands

由表1可知，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，臘腸樣品中的細(xì)菌由Anaerostipes hadrus、約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）、Vibrio litoralis、馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）和未知分類地位的不可培養(yǎng)細(xì)菌構(gòu)成，且環(huán)絲菌屬為其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。

2.2 基于MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)的臘腸細(xì)菌多樣性

較之PCR-DGGE技術(shù)，以MiSeq為代表的第2代高通量測(cè)序技術(shù)具有通量高的優(yōu)點(diǎn)，且實(shí)現(xiàn)了菌群的相對(duì)定量分析，因而本研究進(jìn)一步采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)5 個(gè)臘腸樣品的細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，同時(shí)對(duì)PCR-DGGE的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

通過MiSeq高通量測(cè)序，本研究5 個(gè)臘腸樣品共產(chǎn)生193 486 條高質(zhì)量的16S rDNA序列，平均每個(gè)臘腸樣品產(chǎn)生38 697 條，切除引物和Barcode后序列長(zhǎng)度的分布情況如圖2所示。

圖 2 序列長(zhǎng)度分布圖Fig. 2 Distribution of sequence length

由圖2可知：193 486 條高質(zhì)量的16S rDNA序列中有175 308 條集中在440～459 bp，占到序列總數(shù)的90.61%；18 069 條集中在420～439 bp，占到序列總數(shù)的9.34%。使用QIIME平臺(tái)，對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，共有193 356 條序列通過Align（對(duì)齊），按照100%相似性進(jìn)行Uculst劃分后共得到84 979 條代表性序列，按照97%相似性進(jìn)行Uculst劃分后共得到8 057 個(gè)OTU，且沒有發(fā)現(xiàn)嵌合體。

圖 3 OTU出現(xiàn)頻率和包含序列數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig. 3 Occurrence frequency of OTU and number of sequences within OTU

本研究進(jìn)一步對(duì)OTU在5 個(gè)樣品中出現(xiàn)的頻率和包含序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由圖3可知，在5 個(gè)樣品中出現(xiàn)1、2、3、4 次的OTU分別有6 742、771、289、142 個(gè)，分別占OTU總數(shù)的83.68%、9.57%、3.59%和1.76%，其包含的序列數(shù)分別為18 341、11 093、7 039、19 140 條，分別占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的10.21%、5.76%、3.88%和10.13%。雖然核心OTU僅有113 個(gè)，僅占OTU總數(shù)的1.40%，但其包含的序列數(shù)為137 743 條，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的70.02%。由此可見，5 個(gè)臘腸樣品共有大量的細(xì)菌類群。

表 2 樣品測(cè)序結(jié)果及各分類地位數(shù)量Table 2 Read counts and number of identif i able units at different taxonomical levels

使用RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫比對(duì)后，所有序列鑒定為14 個(gè)門、58 個(gè)綱、90 個(gè)目、110 個(gè)科和261 個(gè)屬。由表2可知，樣品LC1的超Ⅰ指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)值均最大，而樣品LC5的2 個(gè)值均最小，說明樣品LC1的細(xì)菌多樣性最高，而樣品LC5最低，與PCR-DGGE結(jié)果一致。

圖 4 臘腸中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門相對(duì)含量的比較分析Fig. 4 Comparative analysis of the content of the dominant bacterial phyla in sausage samples

進(jìn)一步在門水平上對(duì)臘腸樣品的細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析。由圖4可知，臘腸樣品中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），其平均相對(duì)含量分別為57.01%、30.43%、7.67%、2.63%和2.01%。此外，另有序列被鑒定為TM7、酸桿菌門（Acidobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、綠彎菌門（Chlorof l exi）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、螺旋體（Spirochaetes）和柔膜菌門（Tenericutes），但其累計(jì)平均含量?jī)H為0.13%。由此可見，臘腸樣品中的細(xì)菌主要隸屬于硬壁菌門和變形菌門，其比例占到細(xì)菌總數(shù)的87.44%。

經(jīng)RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有13.72%的序列無法鑒定到屬水平，相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬如圖5所示。

圖 5 臘腸中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量的比較分析Fig. 5 Comparative analysis of the contents of the dominant bacterial genera in sausage samples

由圖5可知，臘腸樣品中共有11 個(gè)細(xì)菌屬的平均相對(duì)含量大于1.0%，其中環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、葡萄球菌（Staphylococcus）、乳酸桿菌（Lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）4 個(gè)屬隸屬于硬壁菌門，其平均相對(duì)含量分別為38.34%、9.79%、2.80%和2.29%。嗜冷桿菌（Psychrobacter）、發(fā)光桿菌（Photobacterium）、綠膿桿菌（Pseudomonas）、不動(dòng)細(xì)菌屬（Acinetobacter）、弧菌（Vibrio）、泛菌屬（Pantoea）和克雷伯氏菌（Klebsiella）7 個(gè)屬隸屬于變形菌門，其平均相對(duì)含量分別為7.55%、5.90%、4.82%、2.19%、1.69%、1.48%和1.33%。由此可見，臘腸樣品中含量最多的細(xì)菌為環(huán)絲菌屬，與DGGE結(jié)果一致。環(huán)絲菌屬為兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，是導(dǎo)致豬肉在低溫冷藏條件下污染的主要細(xì)菌之一[31]。此外，葡萄球菌、綠膿桿菌和克雷伯氏菌亦可對(duì)食品造成污染[32]。因此，接種乳酸桿菌和明串珠菌屬進(jìn)行臘腸的純種發(fā)酵，在保持臘腸加工和貯藏環(huán)境清潔的同時(shí)，對(duì)提升臘腸相關(guān)產(chǎn)品的安全品質(zhì)可能具有積極意義[7]。

圖 6 臘腸中優(yōu)勢(shì)核心OTU相對(duì)含量的比較分析Fig. 6 Comparative analysis of the contents of the dominant core OTUs in sausage samples

對(duì)142 個(gè)相對(duì)含量大于1.0%的核心OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。由圖6可知，臘腸樣品中OTU 6108（隸屬于Brochothrix）、OTU 4346（隸屬于Psychrobacter）、OTU 4525（隸屬于Staphylococcus）、OTU 1679（隸屬于Lactobacillus）、OTU 1064（隸屬于Vibrio）和OTU 7759（隸屬于Staphylococcus）的平均相對(duì)含量分別為36.19%、4.28%、3.35%、2.42%、1.50%和1.49%，均大于1.0%。由此可見，5 個(gè)臘腸樣品共有大量的細(xì)菌類群，6 個(gè)核心OTU占到了序列總數(shù)的49.23%。

3 結(jié) 論

MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果表明：恩施地區(qū)臘腸樣品中的細(xì)菌主要隸屬于硬壁菌門和變形菌門，二者比例占到細(xì)菌總數(shù)的87.44%；113 個(gè)核心OTU中的序列占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的70.02%，說明5 個(gè)臘腸樣品共有大量的細(xì)菌類群。PCR-DGGE與Illumina MiSeq 檢測(cè)結(jié)果均表明恩施臘腸中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為環(huán)絲菌屬。