多烯磷脂酰膽堿在裸鼠模型中逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥的作用及機(jī)制研究

伊慶亭 張紅軍 姜 韜 傅佳雷 華明濤

胃癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，進(jìn)展快、預(yù)后差，其發(fā)病率及死亡率居惡性腫瘤第3位[1]，僅次于肺癌和肝癌。目前主要以奧沙利鉑為主的第三代鉑類藥物的化療為治療胃癌的首選化療方案[2]，但是鉑類藥物的耐藥是目前胃癌化療亟待解決的問題之一。因此尋找有效措施逆轉(zhuǎn)胃癌對(duì)化療藥物的耐藥性對(duì)改善胃癌治療效果有重要的意義。

多烯磷脂酰膽堿(Polyenephosphatidylchol，PPC)是一種生理性磷脂，可以作為一種臨床常用的保肝藥物，課題組在前期研究其對(duì)化療藥物抗腫瘤活性的影響中發(fā)現(xiàn)，多烯磷脂酰膽堿在胃癌SGC-7901細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可與奧沙利鉑產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用[3]。本研究通過觀察多烯磷脂酰膽堿聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)裸鼠荷瘤胃癌細(xì)胞SGC-7901/L-OHP增殖的影響，探討多烯磷脂酰膽堿可能通過TLR4/Nanog/ABCF2途徑逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、動(dòng)物與試劑

細(xì)胞株：人胃腺癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株SGC-7901/L-OHP由上海生命科學(xué)研究院(中國科學(xué)院)細(xì)胞資源中心惠贈(zèng)。飼養(yǎng)動(dòng)物：BALB/c雌性裸鼠40只，4～5周齡左右，體重在18～21 g左右，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，于青島大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)中心在無特定病原體(PSF)環(huán)境下飼養(yǎng)。藥品：多烯磷脂酰膽堿(PPC)購自成都天臺(tái)山制藥有限公司；奧沙利鉑購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibcol BRL公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；胰蛋白酶購自美國Amresco公司；TLR4/Nanog/ABCF2抗體購自中國Elabscience公司；總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司；RT-RNA試劑盒RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和人胃癌裸鼠模型的建立

人胃腺癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/L-OHP常規(guī)傳代，并培養(yǎng)于(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)RPMI 1640培養(yǎng)液中，并于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長。每3天傳代1次。待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，用胰酶將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化，制備成細(xì)胞密度為5×106/L的單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液0.2 mL注射于裸鼠右頸部皮下，大約10天以后，被接種細(xì)胞懸液的裸鼠右頸部皮下均出現(xiàn)長徑約5～8 mm的皮下結(jié)節(jié)，提示移植瘤模型建立成功。

1.3 分組與處理

將40只人胃癌裸鼠移植瘤模型隨機(jī)分為空白對(duì)照組、多烯磷脂酰膽堿(PPC)組、奧沙利鉑(L-OHP)組及奧沙利鉑聯(lián)合多烯磷脂酰膽堿(L-OHP+PPC)組共4組，每組10只：當(dāng)移植瘤直徑達(dá)5～8 mm左右時(shí)給予藥物治療，空白對(duì)照組給予葡萄糖注射液0.2 mL/(只·d)，L-OHP組中L-OHP劑量按30 mg/kg體重計(jì)，每3天腹腔注射給藥一次，每次6 mg/kg，連續(xù)給藥5次；PPC組中PPC按140 mg/kg體重計(jì)，為每天腹腔注射用藥，每次10 mg/kg，連續(xù)給藥14次。L-OHP+PPC組中L-OHP及PPC劑量及注射方法分別同L-OHP組及PPC組，同一天聯(lián)合用藥時(shí)，上午給予PPC，中間間隔4～6小時(shí)，下午給予L-OHP。給藥期間每天觀察裸鼠的精神、飲食、活動(dòng)等一般情況。21天后處死，剝離腫瘤組織，記錄腫瘤體積和抑瘤率，觀察給藥后不同分組腫瘤的增殖是否有影響，分析PPC對(duì)L-OHP抗腫瘤活性的影響。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

自首次給藥起，用游標(biāo)卡尺每3天測(cè)量一次移植瘤大小，記錄其長徑(a)和短徑(b)，并計(jì)算腫瘤體積=(ab2)/2[4]。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、腫瘤體積為縱坐標(biāo)繪制移植瘤生長曲線，停藥后1周用頸椎脫臼法處死裸鼠后剝離腫瘤組織，計(jì)算體積抑瘤率，抑瘤率(瘤體積)=(對(duì)照組平均瘤體積-實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積)/對(duì)照組平均瘤體積×100%。取出的裸鼠腫瘤組織于-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.5 RNA分離和qRT-PCR

用TRIzol試劑提取新鮮冷凍的4組裸鼠移植瘤腫瘤組織的總RNA。并按照試劑盒說明書對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參。將引物和SYBR Premix Ex Taq II加入到20 μL最終反應(yīng)體系中。分別讀取各個(gè)標(biāo)本的待測(cè)基因與內(nèi)參基因的Ct值。實(shí)時(shí)定量PCR在Applied Biosystems7500系統(tǒng)上進(jìn)行。所有樣品一式三份進(jìn)行測(cè)試，所用引物序列詳見表1。

表1 mRNA引物列表

1.6 蛋白質(zhì)的提取、濃度含量的測(cè)定及Western blot分析

取4組移植瘤組織，每組約200 mg，將其加入蛋白裂解液，并組織勻漿，高速低溫離心后收集裂解物(4℃12 000 g，5 min)。使用增強(qiáng)型BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒根據(jù)Broadford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒確定蛋白質(zhì)的濃度。

將等量的每種樣品的蛋白質(zhì)(50 μg)在10%SDS-PAGE凝膠上電泳。然后將蛋白質(zhì)在300 mA，1.5 h條件下轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶在室溫(RT)下將含有蛋白質(zhì)的膜在含有1%Tween-20的TBS中封閉2 h。一抗在4℃孵育過夜。洗滌膜3次，每次10 min，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗-1∶50 000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃搖床孵育2 h。以相同的方式洗滌膜。TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，然后通過使用Bio-Rad GelDoc XR凝膠文獻(xiàn)系統(tǒng)的SuperEnhanced化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)信號(hào)顯色曝光。用ImageJ軟件分析膠片灰度值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 裸鼠成瘤率及精神狀態(tài)

接種10天以后，4組裸鼠均成瘤明顯，成瘤率100%，移植瘤大小均介于5～8 mm之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，裸鼠移植瘤的生長呈膨脹性，未見明顯轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)，剝離瘤體可見包膜完整，邊界清楚。給藥期間，L-OHP組裸鼠進(jìn)食量最少。PPC組和空白對(duì)照組裸鼠進(jìn)食正常。

2.2 各組裸鼠移植瘤生長曲線

給藥后，L-OHP+PPC組及L-OHP組的皮下移植瘤生長速度逐漸低于空白對(duì)照組及PPC組。用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，與空白對(duì)照組相比，PPC組未表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.39)，L-OHP+PPC組與L-OHP組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。

圖1 腫瘤生長曲線Figure 1 Tumor growth curveNote：*P<0.05，** P<0.01，***P<0.001，vs. the control group；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs. the L-OHP group.

2.3 各組移植瘤的瘤體積抑瘤率比較

移植瘤體積變化方面，與空白對(duì)照組相比，L-OHP+PPC組及L-OHP組表現(xiàn)出了明顯的抗腫瘤作用，體積抑瘤率分別為52.72%、34.78%，析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示PPC與L-OHP兩藥對(duì)腫瘤體積影響的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)，PPC提高了L-OHP的抗腫瘤作用(表2，圖2)。

表2 各組移植瘤的瘤體積抑瘤率比較

Note：***P<0.001，vs. control group；###P<0.001，vs. the L-OHP group.

圖2 腫瘤大小的比較Figure 2 Comparison of tumor size in each group

2.4 荷瘤裸鼠腫瘤TLR4、Nanog、ABCF2的mRNA表達(dá)水平的改變

PPC與L-OHP兩藥對(duì)TLR4、Nanog、ABCF2的mRNA表達(dá)水平影響的交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TLR4：P<0.001；Nanog：P<0.001；ABCF2：P<0.001)，L-OHP+PPC組Nanog、TLR4、ABCF2的mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TLR4：P<0.001；Nanog：P<0.001；ABCF2：P<0.001)，與L-OHP組相比均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TLR4：P<0.001；Nanog：P<0.001；ABCF2：P<0.001)(表3，圖3)。

表3 Real-time PCR中TLR4、Nanog、ABCF2基因的mRNA表達(dá)量

Note：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，vs. control group；###P<0.001，vs. L-OHP group.

圖3 各組TLR4/Nanog/ABCF2基因mRNA表達(dá)差異Figure 3 The mRNA expression of TLR4/Nanog/ABCF2 gene in each groupNote：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 vs. control group；### P<0.001，vs. L-OHP group.

2.5 荷瘤裸鼠腫瘤TLR4、Nanog、ABCF2的蛋白表達(dá)水平的改變

在L-OHP+PPC組中TLR4、Nanog和ABCF2蛋白質(zhì)的表達(dá)較L-OHP組降低，用析因設(shè)計(jì)的方差分析PPC與L-OHP兩藥有交互作用，PPC提高了L-OHP的抗腫瘤作用(TLR4：P=0.014；Nanog：P=0.01；ABCF2：P=0.015)(圖4，圖5)。

圖4 Western blot檢測(cè)4組蛋白的表達(dá)Figure 4 The expression of TLR4，Nanog，ABCF2 and β-actin in tumor tissues by Western blot

圖5 Western blot檢測(cè)4組蛋白的表達(dá)Figure 5 Statistical analysis of protein expression of Nanog，ABCF2 and TLR4 after standardized by β-actin in each groupNote：*P<0.05，**P<0.01，vs.the control group，###P<0.01，vs.the L-OHP group.

3 討論

目前我國胃癌以中晚期常見，治療胃癌的主要手段仍是全身化療[2]。在以奧沙利鉑為主的化療方案中，鉑類藥物的耐藥是影響化療療效的主要因素。在臨床中化療時(shí)往往出現(xiàn)肝功能的損傷，多烯磷脂酰膽堿是常用的保肝藥物，其作用于肝細(xì)胞的細(xì)胞膜，影響細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[5]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)首次發(fā)現(xiàn)于黑腹果蠅中，作為一類突變基因致使果蠅胚胎發(fā)育異常[6]。以往的研究中TLRs最突出的生物學(xué)功能是在炎癥方面的調(diào)控[7]。TLR4作為TLRs家族中一員，TLR4受體可激活腫瘤干細(xì)胞Nanog基因從而上調(diào)ABC家族蛋白表達(dá)[8]。Nanog在腫瘤中的表達(dá)與腫瘤分級(jí)、患者生存期密切相關(guān)，干擾Nanog基因的表達(dá)可顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[9-11]。Nanog基因表達(dá)在紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞中比親代細(xì)胞表達(dá)顯著增加。Fujii等[12]與Wang等[13]在人骨肉瘤、軟組織肉瘤及尤文肉瘤組織中檢測(cè)到Nanog基因的表達(dá)，提示Nanog基因的表達(dá)越高，化療藥物越容易耐藥，化療效果越差。ABCF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的一個(gè)亞組，ABCF1，ABCF2和ABCF3[14-15]。據(jù)報(bào)道它們涉及蛋白質(zhì)翻譯和延伸[14]。在耐順鉑的癌細(xì)胞系中鑒定出ABCF2基因擴(kuò)增，表明ABCF2在調(diào)節(jié)順鉑耐藥中的可能作用[16]。然而，目前的研究?jī)H限于將ABCF2表達(dá)與不同腫瘤組織中的臨床病理學(xué)特征相關(guān)聯(lián)，但不能提供ABCF2顯著影響順鉑耐藥性的直接證據(jù)。

基于上述理論，本研究提出了多烯磷脂酰膽堿能否通過TLR4/Nanog/ABCF2基因影響胃癌細(xì)胞的耐藥。多烯磷脂酰膽堿作用于腫瘤細(xì)胞后，不僅具有恢復(fù)細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜正常功能等相關(guān)作用，還具有降低炎癥反應(yīng)，減少脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激等功能。多種細(xì)胞毒性藥物如：奧沙利鉑，主要通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)入細(xì)胞后可與腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的靶目標(biāo)相結(jié)合從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。而這些藥物在細(xì)胞內(nèi)聚集量及作用時(shí)間減少可能是由于腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性或者通透性降低，從而導(dǎo)致擴(kuò)散減慢。多烯磷脂酰膽堿改善細(xì)胞膜的通透性及流動(dòng)性，通過大量的清除氧自由基減輕對(duì)細(xì)胞膜的損害，從而達(dá)到恢復(fù)腫瘤細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)移功能，進(jìn)而提高奧沙利銷在細(xì)胞內(nèi)的累積量，提高奧沙利鉑的抗腫瘤作用。而此次試驗(yàn)證明在多烯磷脂酰膽堿聯(lián)合奧沙利鉑作用在胃癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株(SGC-7901/L-OHP)的逆轉(zhuǎn)耐藥過程中，隨著胃癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株(SGC-7901/L-OHP)移植瘤對(duì)奧沙利鉑敏感性增強(qiáng)和抑瘤率的提高，TLR4/Nanog/ABCF2基因的mRNA和蛋白表達(dá)的降低，進(jìn)一步表明TLR4/Nanog/ABCF2基因在胃癌耐藥機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。但TLR4/Nanog/ABCF2基因三者之間的關(guān)系及通路研究有待進(jìn)一步證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)中L-OHP+PPC組奧沙利鉑聯(lián)合多烯磷脂酰膽堿作用于裸鼠移植瘤后能夠明顯抑制腫瘤發(fā)展，而且與L-OHP組相比，抑瘤率有明顯提高。證明了與奧沙利鉑聯(lián)用時(shí)有交互作用，多烯磷脂酰膽堿明顯提高了在胃癌耐藥細(xì)胞株中奧沙利鉑的抗腫瘤作用，起到了逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用。在L-OHP+PPC組中，TLR4/Nanog/ABCF2三個(gè)基因的mRNA及蛋白的表達(dá)水平較空白對(duì)照組及L-OHP組有明顯抑制。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，多烯磷脂酰膽堿與奧沙利鉑可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且伴有Nanog及ABCF2基因表達(dá)的下降[3，17]。考慮多烯磷脂酰膽堿聯(lián)合奧沙利鉑作用于裸鼠移植瘤后可能通過降低TLR4、Nanog、ABCF2的mRNA及蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)人胃癌耐藥細(xì)胞的耐藥作用。在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)于奧沙利鉑的耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)機(jī)制有了更深一步的了解。為今后的進(jìn)一步臨床試驗(yàn)提供了有力的證據(jù)支持。