水牛MYF5基因克隆分析及真核表達(dá)載體構(gòu)建

張瑞門，鄧彥飛，奉玲麗，崔佳瑜，潘 雨，石德順，韋英明*，楊素芳*

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶生物資源保護(hù)利用國家重點實驗室，廣西南寧530004；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004）

動物骨骼肌發(fā)育過程中，生肌因子5（MYF5）被認(rèn)為是肌源性決定因素之一，誘導(dǎo)祖細(xì)胞建立骨骼肌譜系[1-2]。Zammit等[3]研究指出，轉(zhuǎn)錄因子MYF5、MYOD、Myogenin和MRF4的肌源性調(diào)節(jié)因子家族在誘導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞參與骨骼肌發(fā)育方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。MYF5是胚胎中骨骼肌譜系決定的基本調(diào)節(jié)劑，敲除該基因?qū)⒃斐尚l(wèi)星細(xì)胞失去肌肉分化、再生功能，說明MYF5在肌肉再生中扮演著關(guān)鍵角色[4]。在小鼠胚胎中，MYF5是第1個要表達(dá)的肌源性測定基因[5]。MYF5缺失會使肌纖維修復(fù)和再生功能受到阻礙[6]；MYF5和MYF4同時缺失會使MYOD表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入肌源性程序[5]；當(dāng)這3種生肌決定因子同時缺失時，會導(dǎo)致骨骼肌缺失[7-8]。MYF5基因的表達(dá)量在豬肌肉組織中顯示最高[9-10]，五指山豬背部肌肉組織中MYF5基因的mRNA表達(dá)水平與年齡呈正比。

綜上所述，MYF5及其他肌肉調(diào)節(jié)因子（MRFs）基因家族在小鼠、豬等物種研究中都取得了相應(yīng)進(jìn)展，但在水牛肉質(zhì)方面的研究尚未報道。因此，本研究對廣西沼澤型水牛MYF5基因進(jìn)行克隆，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析該基因氨基酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并構(gòu)建其真核表達(dá)載體，為該基因肌肉發(fā)育調(diào)控機(jī)理及肉質(zhì)改良研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織采集 實驗雄性水牛在廣西南寧市魯班路肉聯(lián)廠屠宰后，用手術(shù)器械采集后腿深部肌肉組織，剪成小塊放入凍存管后立即置于液氮罐中，1～2 h內(nèi)送回實驗室并保存于-80℃冰箱。

1.2 主要試劑 分子生物學(xué)試劑：Trizol試劑購自Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京天根化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，pEASY克隆載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，LB培養(yǎng)基購自北京金橋科技公司。

細(xì)胞生物學(xué)試劑：DMEM高糖基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（GIBCO）、胎牛血清（FBS，GIBCO）、胰酶和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（Life3000，Invitrogen）等均購自Life公司。

其他：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、水牛顆粒細(xì)胞、pMXs-IRES-GFP 載體均為廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物保護(hù)與利用國家重點實驗室保存。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中牛MYF5基因序列（登錄號：NM-174116.1），應(yīng)用Oligo 7.0軟件設(shè)計MYF5特異性擴(kuò)增引物，分別用于目的基因擴(kuò)增（MYF5-CDs）、載體構(gòu)建（MYF5-MQ），具體信息如表1所示，統(tǒng)一由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 RNA提取和cDNA第1鏈的合成 采用Trizol法提取肌肉組織的總RNA，檢測濃度及純度后，篩選質(zhì)量合格的RNA用于cDNA合成。本實驗利用兩步反轉(zhuǎn)法合成cDNA 第1鏈。第1步，去除基因組DNA：7 μL RNA，1 μL gRNA Eeaser及 2 μL 相 應(yīng) 的 Buffer，42℃ 反應(yīng)2 min；第2步，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在去除基因組產(chǎn)物中分別加入1 μL RT primer Mix（反轉(zhuǎn)錄酶），5×Buffer 4 μL，2 μL抑制劑，4 μL dNTP，1 μL隨機(jī)引物，4 μL RNase-free Water，程序為 37℃ 15 min、85℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 產(chǎn)物保存于-80℃冰箱。

1.5 RT-PCR反應(yīng) 擴(kuò)增MYF5基因序列片段時，PCR反應(yīng)體系：2×Taq Mix 酶12.5 μL，上、下游引物各 1 μL， 模 板 2 μL（100 ng/μL）， 三 蒸 水 8.5 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃終延伸5 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.6 PCR產(chǎn)物的連接與測序 PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，將DNA 目的片段回收、純化后，與克隆載體pEASY?-T1 Cloning Vector連接，連接體系為DNA產(chǎn)物4 μL、克隆載體1 μL，25℃反應(yīng)30 min；再把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，并在含有氨芐青霉素（Amp+）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆后，將其置于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過Cracking鑒定，用天根普通質(zhì)粒小提試劑盒獲取重組質(zhì)粒pEASY-MYF5，送至深圳華大基因進(jìn)行測序。

1.7 生物信息學(xué)分析 對水牛MYF5基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析：測定結(jié)果在NCBI中BLAST程序進(jìn)行同源序列比對；分子進(jìn)化樹用MEGA6.0軟件進(jìn)行構(gòu)建；用EXPASY相關(guān)在線服務(wù)器分析水牛MYF5編碼蛋白氨基酸組成、理論分子質(zhì)量和等電點等；利用SMART程序（http://smart.Embl-heidelberg.de）預(yù)測MYF5編碼蛋白氨基酸序列可能存在的蛋白結(jié)構(gòu)域；利用TMHMM Server v.2.0程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMH

MM/）進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測；利用DNAStar中的Protean程序預(yù)測MYF5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；通過SWISSMODEL程序（https://swissmodel.expasy.org/interactive分析預(yù)測MYF5蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.8 真核載體的構(gòu)建 用MYF5（MQ）引物以pEASYMYF5重組質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，PCR擴(kuò)增出帶有酶切位點的目的基因DNA片段。將DNA目的片段和pMXs-IRES-GFP 載體分別用BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，分別回收酶切產(chǎn)物。利用T4連接酶將DNA目的片段與骨架載體進(jìn)行連接。連接體系：骨 架 載 體 4 μL、 目 的 片 段 4 μL、T4 連 接 酶 1 μL、10×Buffer 1 μL，混勻后置于16℃環(huán)境連接反應(yīng)8 h以上，轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒鑒定和提取等嚴(yán)格按照本實驗室的方法[11]和試劑盒進(jìn)行；得到pMXs-MYF5 表達(dá)載體，進(jìn)行質(zhì)粒電泳和質(zhì)粒雙酶切鑒定，并篩選初步鑒定正確的質(zhì)粒，送至深圳華大基因進(jìn)行測序。

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HEK293T細(xì)胞和水牛顆粒細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～85%時，將pMXs-MYF5表達(dá)載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和水牛顆粒細(xì)胞，同時以未轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞為對照。36～48 h后，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)；分別提取轉(zhuǎn)染pMXs-MYF5質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞和對照組HEK293T細(xì)胞的RNA，合成cDNA后利用擴(kuò)增引物進(jìn)行RT-PCR檢測。

表1 MYF5基因引物合成序列

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛MYF5基因的克隆與鑒定 通過Trizol法純化獲得水牛肌肉組織總RNA。從圖1中可以觀察到清晰的28 S和18 S條帶，說明獲得了的RNA可用于下一步的反轉(zhuǎn)錄實驗。對水牛MYF5基因CDS序列設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，經(jīng)測序分析，RT-PCR擴(kuò)增獲得925 bp的特異性條帶（圖2A），其中包括768 bp的CDS序列，預(yù)計編碼255個氨基酸（圖3）。將PCR產(chǎn)物連接克隆到pEASY?-T1 Cloning Vector，載體大小約 4 321 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2B）。

圖1 水牛后腿部肌肉組織RNA的特異性條帶

圖2 水牛MYF5基因克隆

2.2 水牛MYF5基因序列分析 對獲得的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，獲得水牛MYF5基因序列。應(yīng)用NCBI的ORF Finder程序分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)全長768 bp，可編碼255個氨基酸（圖3）。 經(jīng)BLAST軟件相似性比對分析顯示，水牛MYF5核酸序列與牛、山羊、豬、人、猩猩和狼相應(yīng)序列的相似性分別為99%、98%、94%、91%、90%和89%，表明MYF5基因在不同哺乳動物中具有較高的序列保守性。

圖3 水牛MYF5基因序列及其預(yù)測編碼氨基酸序列

2.3 水牛MYF5基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 經(jīng)過進(jìn)化樹分析得出（圖4），水牛與牛的 MYF5基因序列同源性最高，與山羊、豬、馬、人等哺乳動物的遺傳距離相對較近，而與爪蟾、原雞和斑馬魚相距較遠(yuǎn)，進(jìn)化樹的形態(tài)與分類學(xué)保持了較高的一致性，進(jìn)一步證明克隆獲得了水牛MYF5基因。

圖4 水牛MYF5氨基酸序列與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化比較

2.4 水牛MYF5蛋白質(zhì)特性的生物信息分析 通過EXPASY服務(wù)器分析水牛MYF5蛋白質(zhì)的氨基酸組成，該蛋白質(zhì)含有255個氨基酸（圖3和表2），其中絲氨酸含量（12.9%）最高，色氨酸含量（0.8%）最低。MYF5蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為28.27 ku，分子式為C1209H1902N350O397S18，等電點為5.72。MYF5蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測顯示，水牛MYF5蛋白質(zhì)均位于膜外區(qū)域，為膜外蛋白；進(jìn)一步用SMART程序預(yù)測MYF5的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)果顯示，位于第1～88位氨基酸存在1個MYOD家族標(biāo)志性的MYOD結(jié)構(gòu)域：BASIC（圖5）。對水牛MYF5蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步預(yù)測分析，結(jié)果顯示水牛MYF5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中包含14個α-螺旋、6個β-折疊、25個T-轉(zhuǎn)角和22個無規(guī)則卷曲（圖6）；在水牛、牛和人3個物種中MYF5蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)顯示了極高的相似性（圖7）。

表2 水牛MYF5基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

2.5 水牛MYF5基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 獲得正確重組質(zhì)粒pMXs-MYF5（圖8）后，將重組載體用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和水牛卵巢顆粒細(xì)胞，48 h之后，利用熒光顯微鏡操作系統(tǒng)觀察EGFP-MYF5融合蛋白的表達(dá)，細(xì)胞有明顯的綠色熒光（圖9）。經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pMXs-MYF5質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞表達(dá)MYF5基因，而對照組的HEK293T細(xì)胞不表達(dá)該基因（圖10）。

圖5 水牛MYF5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖6 水牛MYF5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖7 不同物種MYF5蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖8 水牛MYF5基因表達(dá)載體構(gòu)建

圖9 pMXs-MYF5載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞

圖10 HEK-293T細(xì)胞中MYF5基因表達(dá)情況

3 討 論

本研究成功克隆了水牛MYF5基因，其編碼區(qū)序列長度為768 bp，共編碼255個氨基酸，核苷酸序列與牛、山羊、豬、人、猩猩和狼相應(yīng)序列的同源性分別為99%、98%、94%、91%、90%和89%；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，水牛MYF5基因在不同物種及進(jìn)化的過程中具有高度保守性；蛋白質(zhì)分析結(jié)果顯示，MYF5蛋白為膜外蛋白，具有MYOD家族標(biāo)志性MYOD結(jié)構(gòu)域。同時，本實驗成功構(gòu)建了水牛MYF5基因真核表達(dá)載體pMXs-MYF5，轉(zhuǎn)染 HEK293T、顆粒細(xì)胞后產(chǎn)生的綠色熒光信號，表明能夠形成MYF5-EGFP融合蛋白。

廣西是水牛養(yǎng)殖大省，但水牛肉質(zhì)相關(guān)研究甚少。MYF5基因與肌纖維的數(shù)量和大小均有關(guān)系，對畜禽的產(chǎn)肉力、肉質(zhì)及風(fēng)味的改善具有十分重要的作用。在其他物種上，MYF5基因表達(dá)模式[12-14]、生長性能關(guān)聯(lián)分析[15-16]均有進(jìn)展。有研究表明，牛MYF5基因具有群體遺傳多態(tài)性[17]，在不同品種中顯示出不同的遺傳效應(yīng)，即不同等位基因上基因頻率有所不同，這暗示著水牛MYF5基因必然存在群體遺傳多態(tài)性。Yin等[18]使用DNA測序方法鑒定并分析了雌性家鴿MYF5和Kruppel樣因子15（KLF15）基因外顯子中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）。近期，Magli等[19]、Watanabe等[20]探討多能干細(xì)胞衍生肌源性細(xì)胞時，認(rèn)為生肌因子MYF5及其家族基因均具有調(diào)控成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞的能力，這有可能與MYF5及其家族基因在組蛋白乙酰化水平[21]、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等機(jī)制存在聯(lián)系。一些研究表明，MYOD可以將脂肪組織轉(zhuǎn)化為肌肉組織[22-24]，而棕色脂肪細(xì)胞來自肌肉干細(xì)胞群[24-26]。對于脂肪細(xì)胞，MYF5是重新啟動脂肪代謝和維持體溫的必須參與者[27-28]。此外，lncRNA與生肌調(diào)控家族基因在脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞之間相互轉(zhuǎn)化中發(fā)揮調(diào)控功能[29]。

MYF5及其家族基因在成肌過程中發(fā)揮著重要的作用[30]，而它們是否參與牛肌內(nèi)脂肪發(fā)育、是否在脂肪發(fā)生過程中發(fā)揮作用，如何調(diào)控肌肉祖細(xì)胞和脂肪祖細(xì)胞的分化等方面，值得探討。因此，牛MYF5及其家族基因在骨骼肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化發(fā)育方面仍需要更多的研究。本研究結(jié)果為繼續(xù)研究MYF5基因在水牛骨骼肌發(fā)育、肌內(nèi)脂肪沉積中的調(diào)控作用及機(jī)制提供了重要的支撐數(shù)據(jù)，為今后將MYF5基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞、前體脂肪細(xì)胞研究 MYF5基因在肌肉發(fā)育中的作用及對脂肪沉積的影響奠定了基礎(chǔ)。