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    響應(yīng)面優(yōu)化乙酸酐改性蛋黃蛋白質(zhì)工藝

    2018-10-23 01:53:12李和平魏建春
    中國(guó)畜牧雜志 2018年10期
    關(guān)鍵詞:乙酸酐乙?;?/a>蛋黃

    李和平,魏建春,付 麗,王 斌

    (河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程工程學(xué)院,河南鄭州 450011)

    我國(guó)是禽蛋生產(chǎn)大國(guó),年產(chǎn)量超3 000萬(wàn)t,約占全球禽蛋產(chǎn)量的45%[1],擁有豐富的禽蛋加工資源。然而我國(guó)禽蛋加工業(yè)與發(fā)達(dá)國(guó)家相比,存在加工能力弱、加工深度低、品種單一等不足。禽蛋蛋黃中含有大量高附加值的活性物質(zhì),蛋黃蛋白質(zhì)便是其中之一。蛋黃中蛋白質(zhì)含量高、種類多、功能豐富,是一種傳統(tǒng)的表面活性劑,在飼料、醫(yī)藥、化工、食品及保健品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。目前,我國(guó)蛋黃分離加工主要以提取蛋黃油脂為主,生產(chǎn)過(guò)程中使用乙醇、甲醇及丙酮等有機(jī)溶劑造成分離加工后蛋黃蛋白質(zhì)不同程度地變性,降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性。

    一般采用酶解、化學(xué)和物理方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性以改善其功能特性。其中,化學(xué)改性由于操作簡(jiǎn)單、方便易行而成為蛋白質(zhì)類改性研究的熱點(diǎn)[3]。酰基化是一種反應(yīng)條件溫和、節(jié)約能源的化學(xué)改性方法,并因能夠用來(lái)生產(chǎn)具有高乳化性、高溶解性及高起泡性等高附加值改性蛋白產(chǎn)品而日益受到重視。乙?;男灾参锏鞍兹缧←溍娼畹鞍?、花生蛋白、大豆分離蛋白和大米蛋白以及蛋黃體系中蛋白質(zhì)的物理及酶改性研究報(bào)道較多[4-13]。迄今為止,利用乙?;磻?yīng)對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)改性的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用乙酸酐對(duì)蛋黃提取脂類后的蛋黃蛋白質(zhì)進(jìn)行改性,以乙酰化程度為評(píng)價(jià)指標(biāo),利用響應(yīng)面法對(duì)乙酰化改性蛋黃蛋白質(zhì)的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)改性后黃蛋白質(zhì)的乳化性進(jìn)行初步研究,為蛋黃蛋白質(zhì)在飼料、醫(yī)藥、化工及保健品領(lǐng)域的工業(yè)化利用開辟新途徑。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑 鮮雞蛋為市售褐殼蛋;乙酸酐為淄博魯中化工輕工有限公司生產(chǎn);其他化學(xué)試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備 JJ-1A精密增力電動(dòng)攪拌機(jī)(武漢格萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司),WFZ-W2000型分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司),PHS-3E酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠),LR10-24A 型離心機(jī)(北京雷勃爾有限公司),SHA-C恒溫振蕩水浴鍋(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司),DHG-9204A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司),R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪高科儀器廠)。

    1.3 蛋黃蛋白質(zhì)的制備 參考趙繪繪等[14]的制備方法,取雞蛋分離出蛋黃,蛋黃攪拌均勻后放入潔凈的帶塞的三角瓶中,加入95%乙醇(用量4.0 mL/g)浸泡、攪拌60 min 后,靜置15 min,抽濾,濾餅用乙醇浸泡、抽濾,重復(fù)2 次。所得濾餅快速揮干即為蛋黃蛋白質(zhì)。

    1.4 乙?;包S蛋白質(zhì)的制備方法 乙酰化蛋黃蛋白質(zhì)的制備是根據(jù)張紅印等[4]報(bào)道的方法,略做修改。取一定質(zhì)量蛋黃蛋白質(zhì)加入純凈水,攪拌30 min溶解后,用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0±0.5,恒溫30℃下按一定速度分批緩慢加入乙酰酐,調(diào)節(jié)pH始終保持在8.0±0.5,反應(yīng)一定時(shí)間后,用2 mol/L HCl調(diào)pH至4.0,3 500 r/min離心10 min收集沉淀,用蒸餾水將沉淀洗滌2次后快速揮干,粉碎至100目得改性蛋黃蛋白質(zhì)。

    1.5 乙?;潭鹊臏y(cè)定 采用Paik等[15]的茚三酮比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的酰化程度。

    1.6 蛋黃蛋白質(zhì)乳化性的測(cè)定 參考李磊等[7]的方法測(cè)定乳化活性(EA/OD500)和乳化穩(wěn)定性(ESI/min)。

    1.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.7.1 蛋白質(zhì)濃度(m/v)對(duì)乙?;磻?yīng)的影響 在濃度(m/v)為1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%的蛋黃蛋白液中分別加入蛋黃蛋白質(zhì)量20%(v/m)的乙酸酐,在溫度30℃、pH在8.0±0.5條件下反應(yīng)100 min后,測(cè)定?;潭取?/p>

    1.7.2 乙酸酐添加量對(duì)乙?;磻?yīng)的影響 在8%(m/v)蛋黃蛋白液中分別加入占蛋黃蛋白質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)(v/m)為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%的乙酸酐,在溫度30℃、pH在(8.0±0.5)條件下反應(yīng)100 min后,測(cè)定酰化程度。

    1.7.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酰化反應(yīng)的影響 在8%(m/v)蛋黃蛋白液中加入占蛋黃蛋白質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)20%(v/m)的乙酸酐,在溫度30℃、pH在8.0±0.5條件下分別反應(yīng) 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min 后,測(cè)定酰化程度。

    1.8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取反應(yīng)時(shí)間、蛋黃蛋白質(zhì)濃度(m/v)和乙酸酐添加量(v/m)3個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn),因素及水平見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

    1.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,取其平均值。采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。乙酸酐改性蛋黃蛋白質(zhì)采用Design-Expert 8.0.6.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單一水解條件分析

    2.1.1 蛋白質(zhì)濃度對(duì)乙?;磻?yīng)的影響 從圖1可以看出,當(dāng)?shù)鞍诐舛葟?%增加到8%時(shí),乙?;潭妊杆偕仙?;當(dāng)?shù)鞍诐舛葟?%增加到16%時(shí),蛋黃蛋白的乙?;潭乳_始降低。其原因是隨著蛋白質(zhì)濃度的增加,高濃度蛋白質(zhì)分子與乙酸酐分子充分碰撞有利于乙?;磻?yīng);但蛋白質(zhì)濃度過(guò)高,溶液體系的粘度增大,蛋白質(zhì)和乙酸酐分子的碰撞減少,最終導(dǎo)致蛋黃蛋白?;潭冉档蚚16]。因此,蛋黃蛋白質(zhì)的最適濃度為8%。

    圖1 蛋白質(zhì)濃度對(duì)乙?;磻?yīng)的影響

    2.1.2 乙酸酐添加量對(duì)乙?;磻?yīng)的影響 從圖2可以看出,當(dāng)乙酸酐添加量從5%增加到20%時(shí),乙酰化反應(yīng)以較快的速度增加,蛋黃蛋白的乙酰化度迅速增加;當(dāng)乙酸酐添加量超過(guò)20%后,乙酰化度增加不明顯。隨著乙酰酐濃度的增加,乙酸酐分子與蛋黃蛋白質(zhì)分子碰撞機(jī)率增大,反應(yīng)速率增加,產(chǎn)物乙酰化程度增加;但當(dāng)乙酰酐達(dá)到一定濃度后,蛋黃蛋白參與?;磻?yīng)的基團(tuán)達(dá)到飽和,乙?;炔辉倜黠@增加[16]。因此,確定乙酸酐的最適添加量為20%。

    圖2 乙酸酐添加量對(duì)乙?;磻?yīng)的影響

    2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙?;磻?yīng)的影響 由圖3可知,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從10 min增加到50 min,乙?;妊杆偕仙?;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)50 min之后,乙?;然颈3趾愣╗17-18];乙?;磻?yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),不利于工業(yè)生產(chǎn),確定乙酰化蛋黃蛋白質(zhì)的最適反應(yīng)時(shí)間為50 min。

    圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙?;磻?yīng)的影響

    2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

    2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果見表2和表3。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,獲得蛋黃蛋白質(zhì)乙酰化度(Y)對(duì)反應(yīng)時(shí)間(A)、蛋白質(zhì)濃度(B)、乙酸酐添加量(C)的二次回歸模型方程:Y=72.00+2.48A+2.62B+8.16C+0.88 AB+0.56AC-0.36BC-2.17A2-1.69B2-3.32C2。

    如表3所示,回歸模型的F值為22.184 9,P 值為0.000 2,達(dá)到極其顯著水平;失擬項(xiàng)不顯著(P=0.210 1),模型的確定系數(shù)R2=0.966 1,可以用該回歸方程對(duì)乙酸酐改性蛋黃蛋白質(zhì)的實(shí)際情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。從F值可知,3個(gè)因素對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)改性效果影響的順序?yàn)镃>B>A。一次項(xiàng)A、B、C對(duì)乙?;磻?yīng)效果影響極顯著(P<0.01)。AB、AC、BC交互作用對(duì)乙?;磻?yīng)效果影響不顯著(P>0.05);二次項(xiàng)A2、B2對(duì)乙?;磻?yīng)效果影響不顯著(P>0.05),C2對(duì)乙?;磻?yīng)效果影響極顯著(P<0.01),說(shuō)明各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

    表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    表3 各因素和回歸方程的方差分析

    2.2.2 響應(yīng)面分析 等高線圖可以直觀反映各因素對(duì)乙酰化程度的交互作用程度[19]。從圖4可以看出,反應(yīng)時(shí)間和蛋白質(zhì)濃度等高線圖是橢圓形的,表明兩者之間的相互作用明顯;反應(yīng)時(shí)間和乙酸酐添加量、乙酸酐添加量和蛋白質(zhì)濃度等高線圖的接近圓形,表明兩者之間的交互作用不明顯。比較圖4各響應(yīng)面曲線可知,在乙酸酐添加量方向的坡面較陡,隨著乙酸酐添加量的增加,乙?;瘸尸F(xiàn)逐步升高的趨勢(shì),并在乙酸酐添加量25.00%附近,乙?;茸罡?,表明乙酸酐添加量對(duì)乙?;扔绊戄^為顯著。蛋白質(zhì)濃度次之,其曲線較平直。反應(yīng)時(shí)間方向的坡面更平直,乙?;鹊纳呲厔?shì)不明顯,說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)乙酰化改性效果影響不顯著。

    圖 4 各交互因素對(duì)乙?;包S蛋白質(zhì)影響的響應(yīng)面及等高線圖

    2.2.3 最佳工藝條件及驗(yàn)證 經(jīng)Design-Expert 8.0.6.1分析得到的預(yù)測(cè)工藝條件為反應(yīng)時(shí)間54.43 min、蛋白質(zhì)濃度9.80%、乙酸酐添加量25.00%,預(yù)測(cè)乙酰化度為79.19%。根據(jù)實(shí)際操作,對(duì)工藝條件進(jìn)行規(guī)范化處理,在反應(yīng)時(shí)間55 min、蛋白質(zhì)濃度10.00%、乙酸酐添加量25.00%條件下,做5次驗(yàn)證性試驗(yàn),結(jié)果蛋黃蛋白質(zhì)乙?;葹?8.98%,與預(yù)測(cè)理論值接近,說(shuō)明此模型優(yōu)化結(jié)果可靠。

    2.3 蛋黃蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果 從表4可以看出,與未改性蛋黃蛋白質(zhì)相比較,乙?;蟮包S蛋白質(zhì)EA和ESI分別提高了67.16%和82.91%,這主要是因?yàn)轷;淖兞说鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu),相鄰分子間的離子鍵減弱,親水性更強(qiáng)[20]。

    表 4 蛋黃蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)

    3 結(jié) 論

    各因素對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)乙?;扔绊懙捻樞?yàn)橐宜狒砑恿浚镜鞍踪|(zhì)濃度>反應(yīng)時(shí)間。乙?;磻?yīng)改性蛋黃蛋白質(zhì)的最適佳工藝條件為反應(yīng)時(shí)間55 min、蛋白質(zhì)濃度10.00%、乙酸酐添加量25.00%,該條件下蛋黃蛋白質(zhì)乙酰化度為78.98%,與預(yù)測(cè)值接近,且改性后蛋黃蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了67.16%和82.91%。該研究結(jié)果將為乙酰化改性蛋黃蛋白質(zhì)生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

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