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    中國荷斯坦奶牛ITGB2基因多態(tài)性及其與乳房炎抗性和產(chǎn)奶性狀的相關(guān)分析

    2018-10-23 01:53:08楊宇澤路永強(qiáng)郭江鵬趙春穎程京媛
    中國畜牧雜志 2018年10期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)奶荷斯坦乳脂

    楊宇澤,馮 濤, 路永強(qiáng),郭江鵬,常 卓,趙春穎,程京媛

    (1. 北京市畜牧總站,北京 100107;2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100097)

    整合素β-2(Integrin Subunit Beta 2,ITGB2)基因,又稱CD18基因,定位于牛1號染色體。ITGB2基因D128G突變可引起牛常染色體隱形遺傳疾病——牛白細(xì)胞粘附綜合征(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency,BLAD),是近年來的研究熱點(diǎn)[1]。ITGB2基因主要在白細(xì)胞表達(dá),相對于非反芻動物,在反芻動物間保守性更高[2]。白細(xì)胞粘附缺陷(Leukocyte Adhesion Deficiency,LAD)主要表現(xiàn)為典型的白細(xì)胞粘附功能異常[3],已在牛[1,4-5]、水牛[6]、狗[4,7-8]和人類[9-10]中發(fā)現(xiàn)該疾病,大部分LAD是由于ITGB2基因D128G突變引起,但也有由ITGB2基因其他突變引起的[4,7,9]。牛ITGB2基因表現(xiàn)出高度多態(tài),除D128G外的其他突變是否與牛體細(xì)胞評分(Somatic Cell Score,SCS)和產(chǎn)奶性狀(305 d產(chǎn)奶量、乳蛋白率、乳脂率、乳蛋白和乳脂)有關(guān)目前還沒有相關(guān)報(bào)道。

    前期本團(tuán)隊(duì)在中國荷斯坦奶牛群體中高體細(xì)胞數(shù)(High Somatic Cell Count,SCC)母牛(SCC>250×105/mL,n=25)與低SCC母牛(SCC<5×105/mL,n=25)ITGB2基因序列比對研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNP位點(diǎn)(389C>T[rs108953545]和774C>T[rs209411752])(楊宇澤等,未發(fā)表),這兩個(gè)SNP位點(diǎn)與中國荷斯坦奶牛乳房炎抗性及產(chǎn)奶性狀是否有關(guān)值得進(jìn)一步研究。因此,本文研究牛ITGB2基因2個(gè)突變位點(diǎn)389C>T和774C>T在中國荷斯坦奶牛群體中的多態(tài)性,并分析其與SCS和產(chǎn)奶性狀的關(guān)系,以期找到與以上性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,為提高奶牛乳房炎抗性和產(chǎn)奶性狀提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 乳房炎評分和產(chǎn)奶性狀數(shù)據(jù)收集 1 212頭中國荷斯坦奶牛第1胎SCS和5個(gè)產(chǎn)奶性狀(305 d產(chǎn)奶量、乳脂和乳脂率、乳蛋白和乳蛋白率)數(shù)據(jù)來自于北京市畜牧總站的DHI(Dairy Herd Improvement)數(shù)據(jù)庫。

    1.2 基因型分析 2016年通過尾靜脈采集北京市郊區(qū)2個(gè)牛場共1 212頭中國荷斯坦奶牛血樣,利用DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit,北京)提取基因組DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測和NanoDrop 1000測定DNA濃度后保存待用。

    奶牛個(gè)體DNA樣品SNP位點(diǎn)基因型測定使用ABI PRISM SNaPshot(Applied Biosystems,CA,USA)方法進(jìn)行。首先用普通PCR體系分別擴(kuò)增包含389和774位點(diǎn)在內(nèi)的片段,389位點(diǎn)擴(kuò)增(產(chǎn)物長度389 bp)引物為F:5'-GAATCTGAATAGGCGTCCTGC-3'和R:5'-GGAGTAGGAGAGGTCCATCAGG-3',774位點(diǎn)擴(kuò)增(產(chǎn)物長度376 bp)引物為F:5'-ACTGGGCATGGAG GATGCAG-3'和R:5'-CGCAAAGTGGAACCCATCG T-3',PCR產(chǎn)物純化后待用。SNaPshot的10 μL反應(yīng)體系中包括 SNaPshot Multiplex 試劑5 μL、混合引物2 μL(389位點(diǎn)引物389F:5'-ttttttttttttttttttttttAGGTCAGGC AGTTGCGTTCAA-3'和774位點(diǎn)引物774R:5'-tttttttt ttttttttttttttttttttttATCGTCCGTGGCGAACACCA-3')、PCR純化產(chǎn)物混合模板2 μL、用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為95℃變性5 min、10個(gè)循環(huán):95℃ 30 s、62℃降至 53℃ 30 s、72℃ 30 s, 接 30個(gè) 循 環(huán):95℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s,72℃ 10 min。擴(kuò)展產(chǎn)物經(jīng)純化后加1單位蝦堿性磷酸酶(SAP)37℃孵育60 min,之后85℃ 15 min使酶滅活。純化后的產(chǎn)物1 μL、Gene Scan-120 LIZ 標(biāo) 品 0.5 μL(Applied Biosystems)和 HI-DI 8.5 μL混 合 后 ABI 3730測 序 儀(Applied Biosystems)上樣。最終,測序結(jié)果用GeneMapper 4.0軟件(Applied Biosystems)分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析 1 212頭中國荷斯坦奶牛是隨機(jī)選擇6個(gè)公牛的后代(206、199、196、191、208、212頭個(gè)體),近年來沒有對SCS及其他乳房炎抗性性狀以及產(chǎn)奶性狀進(jìn)行過選擇。奶牛分娩季節(jié)按每3個(gè)月分為4個(gè)季節(jié):春季(3—5月,295頭)、夏季(6—8月,314頭)、秋季(9—11月,283頭)、冬季(12—2月,320頭)。

    收集1 212頭奶牛對應(yīng)的公牛編號、牛場、產(chǎn)犢季節(jié)、SCS和5個(gè)產(chǎn)奶性狀數(shù)據(jù),利用以下統(tǒng)計(jì)模型對ITGB2基因不同基因型個(gè)體的SCS和產(chǎn)奶性狀進(jìn)行最小二乘方差分析[11-12]:

    其中,yijklm表示基因型對應(yīng)的測定值,μ代表群體均數(shù),Bi代表第i頭公牛的固定效應(yīng)(i=1,2,3,4,5,6),Hj代表第j個(gè)牛場的固定效應(yīng)(j=1,2),CSk代表第k個(gè)產(chǎn)犢季節(jié)的固定效應(yīng)(k=1,2, 3,4),Gl代表第l種基因型的固定效應(yīng)(l=1,2,3或1,2,3,4,5,6),eijklm為隨機(jī)殘差效應(yīng)。利用SAS9.2軟件Proc GLM(General Linear Model)過程完成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 389和774位點(diǎn)基因型及等位基因頻率 在中國荷斯坦奶牛群體中檢測到了ITGB2基因389和774位點(diǎn)多態(tài)性。如表1所示,C等位基因是2個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢等位基因,CT和CC基因型分別是389和774位點(diǎn)的優(yōu)勢基因型??ǚ綑z驗(yàn)顯示中國荷斯坦奶牛研究群體在2個(gè)SNP位點(diǎn)上均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。

    2.2 SNP效應(yīng)與相關(guān)性分析 中國荷斯坦奶牛ITGB2基因2個(gè)SNP位點(diǎn)的效應(yīng)如表2所示,774位點(diǎn)與乳蛋白率顯著相關(guān)(P<0.05),與其他5個(gè)性狀無顯著相關(guān)(P>0.05),其中CC基因型個(gè)體乳蛋白率顯著高于CT和TT型個(gè)體(P<0.05);389位點(diǎn)與6個(gè)性狀均無顯著相關(guān)(P>0.05)。

    2.3 復(fù)合基因型效應(yīng)與相關(guān)性分析 如表3所示,中國荷斯坦奶牛ITGB2基因2個(gè)SNP位點(diǎn)共有6種復(fù)合基因型,復(fù)合基因型與乳脂肪率和乳蛋白率極顯著相關(guān)(P<0.01),與其他4個(gè)性狀無顯著相關(guān)(P>0.05),其中CTCC和TTCC型個(gè)體具有高的乳脂率和乳蛋白率(P<0.01),TTCC復(fù)合基因型個(gè)體具有相對低的SCS(P>0.05)。

    3 討 論

    對ITGB2基因研究較多的主要原因是該基因突變與LAD有關(guān)。在牛上,ITGB2基因編碼區(qū)383位點(diǎn)突變A>G[13]導(dǎo)致細(xì)胞外的高度保守區(qū)糖蛋白128位天冬氨酸被甘氨酸(D128G)取代[14],致使白細(xì)胞表面的β2整合素表達(dá)缺陷,引起牛白細(xì)胞增多等BLAD先天性免疫缺陷病。ITGB2基因D128G突變也在巴基斯坦瘤牛和牛的雜交群體[15]以及印度的水牛群體[6]中發(fā)現(xiàn)。除了D128G突變外,ITGB2基因外顯子5的6個(gè)突變,包括1個(gè)沉默突變(435C>T)和5個(gè)錯(cuò)義突變(338T>C[V113A]、340G>T[A114S]、347A>G[N116S]、348T>C [N116S] 和359G>A[R120Q])也在巴基斯坦瘤牛和牛的雜交群體BLAD牛中檢測到[15]。在狗上,在愛爾蘭雪達(dá)犬LAD個(gè)體中檢測到ITGB2基因107G>C(C36S)突變[4,7]。在人上,ITGB2基因的諸多突變被報(bào)道,F(xiàn)athallah等[9]在人近親群體LAD患者中發(fā)現(xiàn)了ITGB2基因4個(gè)突變,Taghizade等[16]和Yassaee等[17]分別在伊朗LAD患者和LAD家庭ITGB2基因中發(fā)現(xiàn)了12個(gè)純合子突變和14個(gè)突變。本研究中,利用SNaPshot技術(shù)在中國荷斯坦奶牛群體中檢測到ITGB2基因2個(gè)無義突變389C>T和 774C>T。

    表1 中國荷斯坦ITGB2基因2個(gè)SNP位點(diǎn)基因型、等位基因頻率和哈代溫伯格平衡檢測

    候選基因與性狀的相關(guān)性分析能幫助揭示生產(chǎn)性狀的遺傳基礎(chǔ),并且與其他基因技術(shù)相比,該技術(shù)檢測便捷且在育種過程中更容易操作[18]。就ITGB2基因而言,D128G突變是造成牛和水牛LAD的主要原因[6,15,19]。通過LAD患病個(gè)體與健康個(gè)體ITGB2基因序列比較,發(fā)現(xiàn)除D128G之外的其他突變與狗[4,7]和人[9]的LAD有關(guān)。在本研究中,相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),前期在中國荷斯坦奶牛群體SCC極端個(gè)體ITGB2基因序列比對分析中發(fā)現(xiàn)的389C>T和774C>T突變與奶牛SCS無顯著相關(guān),說明這2個(gè)位點(diǎn)與BLAD無關(guān),不能用于奶牛乳房炎抗性育種中;然而在774C>T位點(diǎn),攜帶CC基因型的個(gè)體比攜帶CT和TT基因型的個(gè)體乳蛋白率更高,說明774C>T位點(diǎn)的CC基因型可以作為中國荷斯坦乳品質(zhì)的一個(gè)潛在的分子標(biāo)記。

    眾所周知,單個(gè)SNP的基因型可能會影響到臨近SNP的基因型,復(fù)合基因型能夠反映多個(gè)SNP間的互作[20]。因此,復(fù)合基因型的效應(yīng)要優(yōu)于單個(gè)基因型,這是因?yàn)榛蛐椭g的連鎖遺傳效應(yīng)較單個(gè)SNP更為高效[21]。本研究在中國荷斯坦群體ITGB2基因389C>T-774C>T位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了6種復(fù)合基因型,并且復(fù)合基因型與乳蛋白率和乳脂率極顯著相關(guān),其中CTCC和TTCC復(fù)合基因型個(gè)體有更高的乳脂率和乳蛋白率;更重要的是,TTCC復(fù)合基因型個(gè)體具有更低的SCS。該結(jié)果暗示在中國荷斯坦群體中增加ITGB2基因389C>T-774C>T位點(diǎn)TTCC基因型有望在提升乳品質(zhì)的同時(shí)降低SCS。

    表2 中國荷斯坦奶牛ITGB2基因2個(gè)SNP位點(diǎn)SCS和產(chǎn)奶性狀的效應(yīng)

    表3 Smad3基因第6、7外顯子與京海黃雞體重的關(guān)聯(lián)分析 g

    4 小 結(jié)

    本研究發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦奶牛ITGB2基因389C>T和774C>T位點(diǎn)復(fù)合基因型主要與產(chǎn)奶性狀而非乳房炎抗性有關(guān)。在奶牛育種中,ITGB2基因TTCC基因型是提高乳蛋白率、乳脂率和乳房炎抗性潛在的分子標(biāo)記。

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