SMYD3對氯化鈷誘導T47D乳腺癌細胞缺氧的影響分析

王 蕾，董青青，苗 峙，徐曼麗，張同存，羅學剛

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

乳腺癌是世界高發(fā)癌癥之一，是威脅女性生存的首要因素．目前，乳腺癌在我國呈現(xiàn)出了發(fā)病年齡年輕化、惡性程度不斷升高、發(fā)病率增加而預后差等特點[1]．與其他惡性腫瘤一樣，乳腺癌細胞往往因為增殖迅速而導致附近組織血管氧供血不足，并可在缺氧條件下生存，誘導惡性選擇及遷移的發(fā)生．因此，探究乳腺癌等惡性腫瘤細胞的缺氧應答機制對于相關疾病的臨床合理用藥及新藥研發(fā)具有十分重要的理論指導意義．

SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)是2004年由日本科學家 Hamamoto等[2]發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基化酶，可特異性甲基化組蛋白 H3K4、H4K5、H4K20[3-5]，并作為轉錄因子與靶基因啟動子上的“CCCTCC”或“GGAGGG”結合，調控基因轉錄表達、參與信號轉導過程．研究[2，6-7]已發(fā)現(xiàn)，SMYD3在乳腺癌、肝癌、結直腸癌、宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤中均存在高表達，并參與細胞增殖、黏附與遷移[8-11]．然而，迄今為止，SMYD3與腫瘤細胞缺氧應答的關系在國內外均未見報道．鑒于此，本文對氯化鈷(CoCl2)誘導缺氧損傷情況下，檢測 T47D乳腺癌細胞的存活、細胞周期以及SMYD3轉錄水平的變化，并就SMYD3過表達對氯化鈷作用的影響情況進行了分析與探討．

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器

人乳腺癌細胞系 T47D購自上海哈靈生物有限公司，并在本實驗室長期保存．胎牛血清，天津康源生物技術有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國 Gibco公司；CoCl2，美國 Sigma公司；Trizol試劑、M-MLV逆轉錄試劑盒，美國 Invitrogen公司；SYBR GREEN染料，德國 DBI公司；青霉素、鏈霉素、胰酶、MTT、PI及RNase A，北京索萊寶科技有限公司．pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3質粒由美國 OSI制藥公司Kenneth W．Foreman博士饋贈[12]．

ABI-Step OneTM型實時熒光定量 PCR儀，美國ABI公司；BD Accuri C6流式細胞儀，美國 BD公司．

1.2 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞系 T47D使用含 10%,胎牛血清、100,U/mL青霉素、0.1,mg/mL鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)基，在飽和水蒸氣、5%,CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行37,℃貼壁培養(yǎng)．待細胞匯合度達到 70%～90%,時，采用0.25%,胰酶溫和消化傳代．

1.3 MTT法

將細胞以每孔 5×103個細胞的細胞密度種入96孔板中，12,h后換成無血清的基礎培養(yǎng)基，進行24,h細胞歸一化處理．第 2天，加入 CoCl2溶液(終濃度為 0、50、100、200、400,μmol/L)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24,h．隨后，每孔加入10,μL 5,mg/mL MTT溶液，避光 37,℃反應 4,h后隨即棄去培養(yǎng)基，加入 150,μL DMSO溶解形成的甲瓚結晶．在酶標儀中檢測570,nm 波長下的吸光度，按照式(1)計算相對細胞活力．

1.4 流式細胞術

收集處理組和對照組細胞，用 4,℃預冷的 PBS洗滌2次后，將細胞滴加至PBS稀釋的75%,乙醇中固定，-20,℃靜置過夜．第 2天，將固定好的細胞離心收集，并用 PBS清洗 2次后，加入 500,μL含50,μg/mL PI和 0.1%, RNase A 的 PBS 并吹勻，4,℃避光染色 30,min后即可使用流式細胞儀進行檢測，數(shù)據(jù)由ModFIT軟件進行分析．

1.5 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

將細胞以 5×104,mL-1種入 6孔板中，待細胞完全貼壁后梯度加入 CoCl2至終濃度為 0、50、100、200、400,μmol/L，放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 24,h．第 2天，將處理過的細胞加入 1,mL Trizol，4,℃下裂解提取RNA．取2,μg總RNA加入M-MLV及隨機引物，進行逆轉錄得到cDNA，隨后即可進行PCR．PCR所用到的引物序列為：GAPDH，上游 5'-ATTCAACG GCACAGTCAAGG-3'，下游 5'-GCAGAAGGGGCG GAGATGA-3'；SMYD3，上游 5'-CCCAGTATCTCT TTGCTCAATCAC-3'，下游 5'-ACTTCCAGTGTGCC TTCAGTTC-3'．PCR 反應條件為：95,℃預變性10,min；95,℃ 15,s，60,℃ 1,min，共 40 個循環(huán)，并以ΔΔCt法對結果進行計算．

1.6 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計

本文所有實驗結果均至少重復3次，實驗結果數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，數(shù)據(jù)由 Graphpad Prism 5.0進行統(tǒng)計分析，*和**分別表示與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)和極顯著差異(P＜0.01)．

2 結果與分析

2.1 CoCl2抑制T47D細胞的活力

在加入 CoCl2處理 24,h后，MTT法檢測 CoCl2對 T47D細胞的增殖影響情況發(fā)現(xiàn)：隨著濃度的增加，T47D細胞增殖受到明顯抑制，呈現(xiàn)出顯著的濃度依賴性(圖 1)．在 400,μmol/L CoCl2處理后，細胞存活率降到了(58.36±8.31)%，活細胞數(shù)明顯低于對照組細胞(P＜0.01)，表明 CoCl2誘導的化學缺氧會對細胞產生損傷，抑制細胞活力．

圖1 CoCl2對T47D細胞增殖的影響Fig. 1 Effect of CoCl2 on proliferation of T47D cells

2.2 CoCl2誘導T47D細胞產生G0/G1期周期阻滯

為進一步探究 CoCl2對 T47D細胞活力的抑制作用機制，采用流式細胞術對加藥后的細胞周期分布進行了檢測，結果如圖2所示．在0、100、400,μmol/L CoCl2培養(yǎng)24,h后，T47D細胞的G0/G1期含量發(fā)生了不同程度的變化．隨著 CoCl2給藥濃度的增加，G0/G1期細胞峰型面積呈顯著的上升趨勢，與對照組細胞相比，加入 400,μmol/L CoCl2處理 24,h后，G0/G1期細胞明顯增多(P＜0.05)(圖 3)，在總體細胞中所占比例由(50.32±1.12)%增至(75.69±3.58)%，而 S期細胞所占比例則由(26.48±0.75)%,降至(10.87±0.49)%，表明 CoCl2能夠抑制細胞由G1期進入S期，從而影響細胞的復制，抑制其增殖．

2.3 CoCl2抑制SMYD3的轉錄

前人研究[10,13]已表明，SMYD3是雌激素受體重要的輔助因子，對于乳腺癌細胞的增殖、遷移具有十分重要的作用．Ren等[14]在雌激素受體陰性乳腺癌細胞 MDA-MB-231中干擾 SMYD3后發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力受到明顯的抑制，且細胞周期被阻滯在了G0/G1期．

圖2 CoCl2對T47D細胞周期的影響Fig. 2 Influence of CoCl2 on cell cycle of T47D breast cancer cells

圖3 CoCl2對T47D細胞的周期分布比率的影響Fig. 3 Effect of CoCl2 on the cell distribution ratio of T47D cells

在此，首先在本實驗所用的雌激素受體陽性乳腺癌細胞 T47D中就 SMYD3對細胞周期的影響情況進行了分析，結果如圖 4和圖 5所示．用特異性siRNA抑制內源SMYD3表達后，T47D細胞同樣會發(fā)生 G0/G1期阻滯，表現(xiàn)出了與 CoCl2處理相類似的現(xiàn)象．因此，推測在 CoCl2誘導 T47D 細胞產生G0/G1期阻滯、抑制細胞增殖的過程中，SMYD3很可能也牽涉其中．為驗證這一假設，通過熒光定量RT-PCR方法對不同濃度 CoCl2處理后 SMYD3的mRNA水平進行了檢測，結果如圖6所示．

圖4 干擾SMYD3誘導T47D細胞產生G0/G1期阻滯Fig. 4 SMYD3 absence induced G0/G1 arrest in T47D breast cancer cells

圖5 干擾SMYD3周期分布圖Fig. 5 Ratio of cell distribution of SMYD3 absence

圖6 CoCl2對SMYD3轉錄的影響Fig. 6 Effect of CoCl2 on the transcription of SMYD3

由圖6可知：在CoCl2濃度大于100,μmol/L時，SMYD3的轉錄水平顯著下降(P＜0.01)，至濃度達到400,μmol/L時，SMYD3的mRNA水平降到了對照細胞的1/5左右(0.20±0.12)．

2.4 過表達SMYD3抑制CoCl2對T47D細胞的作用

從圖 1—圖 6結果可以看出，CoCl2對 T47D細胞的缺氧損傷作用很可能與其對 SMYD3的轉錄抑制有關．為進一步驗證這一結論，將 SMYD3的過表達質粒 pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3轉入 T47D細胞使 SMYD3過表達(圖 7)，探究其是否可以抵消CoCl2對細胞的缺氧損傷作用．MTT檢測結果顯示：與轉染空質粒的對照組相比，過表達SMYD3可增強細胞的增殖活力，并抑制 CoCl2對細胞的增殖抑制作用(圖 8)．

圖7 過表達SMYD3的mRNA水平Fig. 7 The mRNA level of overexpressed SMYD3

圖8 過表達SMYD3抑制CoCl2誘導的抗增殖作用Fig. 8 Effect of SMYD3 overexpression on CoCl2-induced antiproliferation in T47D breast cancer cells

進一步檢測細胞周期(圖 9)發(fā)現(xiàn)：在過表達SMYD3與 CoCl2同時給藥 200,μmol/L時，G0/G1期細胞含量(56.05±0.72)%較單過表達 SMYD3組(50.98±0.49)%有所升高，但比單加 200,μmol/L CoCl2組(64.21±1.46)%明顯降低，周期分布比率見圖10．結合MTT結果(圖8)，這些現(xiàn)象提示SMYD3的過表達可對 CoCl2誘導的缺氧損傷產生一定的保護作用，即SMYD3可提高癌細胞在缺氧條件下的存活能力．

圖9 SMYD3對CoCl2誘導的周期阻滯的影響Fig. 9 Effect of SMYD3 on CoCl2-induced cell cycle arrest

圖10 細胞周期分布比率圖Fig. 10 Ratio of cell distribution

3 討 論

SMYD3已被證實在乳腺癌、肝癌、結直腸癌等多種癌組織中都有異常的高表達，而在相應的正常組織中表達量低[2]，這與腫瘤患者的存活率密切相關[7,,15]．Ren等[14]研究表明，敲低 SMYD3可以促進乳腺癌細胞產生周期阻滯，抑制其增殖；Tsuge等[16]認為，SMYD3是 RB-E2F信號轉導通路中的一個下游靶點，5′-CCGCC-3′序列拷貝數(shù)降低將可能降低SMYD3與 E2F-1的親和力，從而使結腸癌、肝癌和乳腺癌發(fā)生幾率降低；還有研究[17]表明，SMYD3通過調控一系列靶基因及信號通路，參與到了肝癌與結腸癌的增殖和上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)進程中，促使腫瘤惡化及轉移．此外，本課題組前期研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，SMYD3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，干擾SMYD3可抑制宮頸癌細胞的增殖與遷移[8]；過表達 SMYD3可上調遷移標志基因 MYL9，與 MRTF-A 協(xié)同促進乳腺癌發(fā)生遷移[9]．由此可見，SMYD3已被視為是非常有潛力的腫瘤基因治療及藥物研發(fā)新靶點之一．

由于腫瘤細胞增殖迅速，周圍組織血管逐漸無法提供足夠的氧氣，而容易在腫瘤內部形成缺氧微環(huán)境．缺氧會對細胞產生殺傷和抑制作用，例如：臨床上就有針對局部晚期腫瘤的 SFP(hypoxic antiblastic stop-flow perfusion)缺氧療法[20-21]，即通過充氣氣囊導管將腫瘤與血管隔離，截斷腫瘤的血氧供應，從而殺傷腫瘤細胞．然而，在低氧環(huán)境下，腫瘤細胞會逐步改善自身基因表達情況，通過增強糖酵解代謝、促進血管新生等方式，提升對缺氧環(huán)境的適應能力．這種缺氧微環(huán)境及與之相伴隨的代謝方式等的改變，是惡性腫瘤細胞中普遍存在的生化特征，被稱為瓦博格效應[22]．盡管低氧糖酵解途徑較有氧的線粒體氧化磷酸化途徑產能效率低，但卻可為腫瘤細胞快速提供ATP以及細胞分裂增殖所必需的前體物質，同時產生大量乳酸，形成酸性微環(huán)境，既可抵御免疫細胞、免疫分子及抗癌藥物的殺傷作用，還可分解破壞細胞基質，促進腫瘤細胞浸潤和轉移．因此，對低氧損傷的耐受能力增強是腫瘤細胞惡性轉化、侵襲轉移和對放化療抵抗的重要原因之一[23-24]．

CoCl2模擬腫瘤細胞低氧環(huán)境是體外誘導細胞缺氧的經典模型，研究表明 CoCl2可通過置換脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases，PHD)輔因子中的 Fe2+，阻斷氧信號的轉導，阻止 HIF-1α 被羥化，同時影響抑癌基因產物 pVHL結合 HIF-1α 氧依賴性降解區(qū)域(ODD)，從而穩(wěn)定細胞內 HIF-1α 的表達，引起一系列細胞對缺氧的反應．因此，CoCl2得到了國內外關于體外缺氧研究的廣泛應用[25-28]．在本研究中，通過CoCl2來誘導缺氧環(huán)境，探究缺氧環(huán)境對人乳腺癌細胞 T47D增殖能力及細胞周期的影響機制．結果發(fā)現(xiàn)：CoCl2誘導缺氧可引發(fā)細胞 G0/G1期阻滯、抑制癌細胞增殖，這一過程與其對SMYD3的轉錄抑制密切相關，而人為過表達SMYD3則可緩解缺氧誘導的G0/G1期阻滯及增殖抑制效應．這些結果表明：SMYD3對乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的推動作用，很可能與其提高細胞對缺氧環(huán)境的耐受能力有關．