針灸對CTX小鼠骨髓細(xì)胞DNA修復(fù)基因XRCC1和ADPRT的調(diào)控作用?

于冬冬，牛云云，路 玫，付雪鴿，滕迎春

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院, 鄭州 450008； 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)國際教育學(xué)院, 鄭州 450008；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000)

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是目前廣泛應(yīng)用于腫瘤化療的一類烷化劑藥物,其在殺傷腫瘤細(xì)胞作用的同時(shí)，可引起正常細(xì)胞尤其是增殖旺盛的骨髓造血干細(xì)胞DNA鏈內(nèi)和鏈間的交叉連接，干擾其轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，從而造成DNA的損傷，最終導(dǎo)致骨髓抑制。受損細(xì)胞DNA主要通過修復(fù)和凋亡來保護(hù)其正常的生理功能和穩(wěn)定的遺傳性狀[1]。堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)是主要的DNA損傷修復(fù)途徑，其對烷化劑、電離輻射和類輻射藥物等導(dǎo)致的單鏈斷裂具有修復(fù)作用。作為BER的主要參與者，XRCC1編碼的蛋白質(zhì)與DNA連接酶Ⅲ相互作用，可修復(fù)DNA單鏈斷裂。研究表明，XRCC1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)陽性率越高，則DNA修復(fù)能力越強(qiáng)[2]。ADPRT作為堿基切除修復(fù)系統(tǒng)的核心蛋白成員，激活后與XRCC1相互作用共同完成DNA損傷修復(fù)過程。課題組前期研究已證實(shí)，針灸可顯著上調(diào)化療機(jī)體骨髓細(xì)胞DNA切除修復(fù)蛋白-polβ的蛋白表達(dá)及RNA轉(zhuǎn)錄，提高堿基切除修復(fù)能力，發(fā)揮其抗CTX化療損傷，改善骨髓抑制的作用[3]。本研究通過觀察針灸干預(yù)后XRCC1、ADPRT的含量變化，探討針灸抗骨髓抑制又一新的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用清潔級雄性昆明種(KM)小鼠40只(由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，SCXK(豫)2010-0002)，體質(zhì)量(20±2) g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組各10只，均在清潔級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)溫度21～ 25 ℃，相對濕度60%，光照時(shí)間12 h，國家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng)，自由飲食。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 注射用環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn))0.9%NaCl溶液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司)；小鼠XRCC1、ADPRT ELISA檢測試劑盒(河南華豫教學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器用品營銷部提供)；過氧化物酶(HRP，上海晶純生化科技股份有限公司生產(chǎn))；四甲基聯(lián)苯胺(TMB，上海晶純生化科技股份有限公司生產(chǎn))。

1.2.2 儀器 超凈工作臺、凍存管、EP管、薄片離心機(jī) SHANDON、槍頭、電子天平、移液器，1 mL、5mL一次性注射器，秒表、醫(yī)用橡膠手套、燒杯、鼠板、鼠夾(自制)、華佗牌針灸針(規(guī)格0.19 mm×10 mm，蘇州醫(yī)療器械用品有限公司生產(chǎn))、特制美容艾條(規(guī)格0.4 cm×25 cm，河南南陽臥龍艾絨廠生產(chǎn))等。

1.3 造模

采用環(huán)磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制小鼠模型，除空白組外，其余各組腹腔注射CTX100 mg/(kg·d)(按照小鼠體質(zhì)量0.02 ml/g用藥量，注射濃度為5 mg/mL的CTX溶液)，后分別在首次注藥的24 h、48 h后再行CTX注射，連續(xù)3 d停藥4 h后模型即成[4]。 空白組腹腔注射等量0.9%NaCl溶液。

1.4 取穴及治療方法

取穴：大椎、膈俞、腎俞、足三里。小鼠穴位定位參考《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》[5]，并模擬大鼠穴位定位法，大椎位于背部正中第7頸椎與第1胸椎之間；膈俞位于第7胸椎下兩旁，肋間左右側(cè)各1穴；腎俞在第2腰椎下兩旁，左右側(cè)各1穴；足三里位于小鼠后肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處，左右各1穴[6]。

針刺組按照各組造模時(shí)間的先后順序，造模完成后施以針刺治療，各組小鼠配對同時(shí)進(jìn)行，采用管式進(jìn)針法直刺，進(jìn)針3 mm，留針6 min。艾灸組在造模完成后開始艾灸治療，各組配對同時(shí)進(jìn)行，用美容細(xì)艾條點(diǎn)燃后，在距離穴位皮膚2 cm處固定懸灸3 min。模型組、空白組每日抓取陪同固定6 min，不予治療，均每日1次，連續(xù)5 d。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測CTX小鼠骨髓細(xì)胞中基因XRCC1和ADPRT含量

治療5 d結(jié)束后于第6天取材。在超凈工作臺上取雙側(cè)股骨剔除肌肉和結(jié)締組織，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液沖洗2遍后，用無菌眼科小剪刀上端剪口，用5 mL注射器抽取3.6 mL的0.9%氯化鈉溶液注入骨髓腔，反復(fù)2～3遍沖洗其全部有核細(xì)胞，離散成單個(gè)細(xì)胞懸液，將骨髓細(xì)胞懸液注入凍存管內(nèi)密封好，再放入-80 ℃低溫冰箱保存，以備檢測骨髓細(xì)胞中XRCC1和ADPRT的含量。用ELISA法進(jìn)行檢測：①從室溫平衡 20 min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃鋁箔袋中；②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；③樣本孔先加待測樣本 10 μL，再加樣本稀釋液40 μL(即樣本稀釋5倍)，空白孔不加；④除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體 100 μL， 用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；⑤棄去液體吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液靜置1 min，甩去洗滌液吸水紙拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)；⑥每孔加入底物 A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育 15 min；⑦每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的OD 值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

表1顯示，與空白組比較，模型組、針刺組和艾灸組小鼠骨髓細(xì)胞DNA中XRCC1、ADPRT表達(dá)含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明CTX化療致小鼠骨髓細(xì)胞DNA受損；與模型組比較，針刺組和艾灸組小鼠骨髓細(xì)胞DNA中XRCC1、ADPRT表達(dá)含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明針刺和艾灸能夠上調(diào)CTX化療小鼠骨髓細(xì)胞DNA中XRCC1與ADPRT的表達(dá)含量，提高細(xì)胞DNA堿基切除修復(fù)能力，對抗CTX化療所致細(xì)胞DNA損傷，減輕骨髓抑制。與艾灸組比較，針刺組XRCC1、ADPRT含量較高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但針刺有優(yōu)于艾灸的趨勢。

表1 針灸對CTX小鼠DNA堿基切除修復(fù)基因XRCC1、ADPRT含量的影響

注：與空白組比較:1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討論

環(huán)磷酰胺(CTX)是具有細(xì)胞毒性的化療藥物，可引起骨髓抑制、外周白細(xì)胞減少等一系列不良反應(yīng)。中醫(yī)并無“骨髓抑制”這一病名，根據(jù)癥狀表現(xiàn)屬于“虛勞”范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“正氣存內(nèi)，邪不可干”“恬淡虛無，真氣從之，精神內(nèi)守，病安從來”，表明疾病的產(chǎn)生與機(jī)體內(nèi)在的機(jī)能狀態(tài)密切相關(guān)。病機(jī)雖復(fù)雜，無外乎先后天之本失調(diào)與氣血陰陽不和，治療原則當(dāng)以培補(bǔ)先后天之本為主，兼以補(bǔ)氣調(diào)血。選取諸陽之會(huì)大椎穴，激發(fā)諸陽經(jīng)之氣，補(bǔ)正氣祛邪氣，調(diào)暢經(jīng)絡(luò)之氣使其補(bǔ)而不滯。血會(huì)膈俞，取其養(yǎng)血生血、健脾補(bǔ)心之力。取腎臟之氣輸注的腎俞、足陽明胃經(jīng)的合穴及胃腑的下合穴足三里，共奏培補(bǔ)先后天之本、補(bǔ)脾益腎、調(diào)補(bǔ)氣血之功。

XRCC1是X射線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因1的英文簡稱，是第一個(gè)分離出影響細(xì)胞對電離輻射敏感性的哺乳動(dòng)物基因，在廣泛參與化學(xué)誘變劑與電離輻射所致 DNA損傷后的單鏈斷裂修復(fù)和堿基切除修復(fù)過程中扮演著極為重要的角色[7]。XRCC1作為具有橋梁作用的蛋白，共有3個(gè)功能域，即位于中間的BRCT-Ⅰ域、XRCC1 C端的BRCT-Ⅱ域和N端的功能域。其中BRCT-Ⅱ域能與DNA連接酶Ⅲ綁定在一起形成復(fù)雜的連接體，BRCT-Ⅰ域可與PARP相互作用，N端的功能域與DNA聚合酶β結(jié)合，分別參與DNA堿基切除修復(fù)及DNA單鏈斷裂修復(fù)的過程[8-9]。本研究結(jié)果顯示，針灸能顯著提高CTX化療小鼠骨髓細(xì)胞DNA中XRCC1的表達(dá)含量，揭示其具有促進(jìn)堿基切除修復(fù)能力，改善骨髓抑制的作用。

ADPRT是二磷酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶的英文簡稱，是真核細(xì)胞中催化聚二磷酸腺苷核糖化的細(xì)胞核酶。其通過識別受損斷裂的DNA鏈，且使多種核受體蛋白(包括自身)發(fā)生多聚ADP核糖化，從而參與BER過程。當(dāng)ADPRT迅速結(jié)合在DNA斷鏈處時(shí)，引發(fā)自身多聚核糖化而被激活。被激活的ADPRT與XRCC1共同募集DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ，并使其緊密連接形成復(fù)合體，完成DNA損傷修復(fù)過程[10]。ADPRT表達(dá)下降時(shí)，提示在BER過程中，部分DNA損傷未能得到有效修復(fù)，受損的DNA增加了基因組的不穩(wěn)定性與發(fā)生突變的頻率，當(dāng)同時(shí)存在其他重要的基因突變或缺失時(shí)則導(dǎo)致細(xì)胞的癌變[11]。因此保持ADPRT的正常含量，提高堿基切除修復(fù)能力，對維持DNA的正?；钚杂绕渲匾?。

本實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，小鼠腹腔注射CTX后，骨髓細(xì)胞DNA中XRCC1、ADPRT含量均明顯降低，經(jīng)針刺、艾灸治療后，與模型組比較針刺組、艾灸組骨髓細(xì)胞DNA中的XRCC1、ADPRT含量均明顯升高。本研究結(jié)果揭示，通過針刺和艾灸干預(yù)后能夠上調(diào)CTX化療小鼠骨髓細(xì)胞DNA中，參與BER過程中的核心蛋白XRCC1和ADPRT的表達(dá)含量，協(xié)同有效地參與堿基切除修復(fù)系統(tǒng)，從而提高骨髓細(xì)胞DNA堿基切除修復(fù)能力，減輕因CTX化療所致骨髓細(xì)胞DNA損傷，減輕骨髓抑制，從BER修復(fù)系統(tǒng)為針灸抗骨髓抑制闡釋了又一新的分子生物學(xué)途徑。