健脾解毒中藥對鉛中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷及海馬Ng表達的影響?

羅 紅，胡必成，王 順，鐘新生，譚 璐，馬 軍，馬 威

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，武漢 430022)

鉛是一種可在環(huán)境中長期蓄積的重金屬元素，能對環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品甚至食物造成污染，是目前常見、重要的工業(yè)及環(huán)境污染物。近年來，隨著我國城市化、工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，環(huán)境中鉛濃度不斷增高。由于嬰幼兒的血腦屏障發(fā)育不完善，鉛很容易進入腦組織形成神經(jīng)毒性，在兒童表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力降低及行為發(fā)育異常。神經(jīng)顆粒素(neurogranin,Ng)是一種可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能的特異性腦蛋白，主要分布于海馬、前額葉皮質(zhì)等與認知功能高度相關(guān)的區(qū)域，是PKC作用底物和鈣離子敏感性鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)的親和蛋白。Ng主要通過調(diào)控Ca2+/CaM依賴蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ,CaMKⅡ)等參與突觸可塑性調(diào)控[1]，Ng基因敲除的小鼠長時程增強(Long-term potentiation，LTP)和空間學(xué)習(xí)能力受損明顯[2]。早期的研究表明，染鉛大鼠海馬Ng蛋白表達顯著減少，并伴有學(xué)習(xí)記憶能力的降低[3]。通過本研究，探討健脾解毒中藥驅(qū)鉛顆粒改善慢性鉛中毒引起的學(xué)習(xí)記憶損傷與Ng、CaMKⅡ表達之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量(140～160) g，雌雄各半，購自湖北省實驗動物中心(動物合格證號00015993)。動物實驗在武漢市第一醫(yī)院SPF動物室(許可證號SYXK(鄂)2008-0030)進行(省動物設(shè)施使用證號為00021583)。動物室內(nèi)溫度20～22 ℃，濕度40%～70%，12/12晝夜交替，大鼠喂飼已輻照消毒的維持飼料(北京華阜康公司)，自由飲去離子水。

1.2 實驗器材

上海吉量Morris水迷宮、PE-3110原子吸收光譜儀、MK-II型微波消化爐、自動雙重純水蒸餾器、Sysmex XE-2100 血液分析儀、722型分光光度計、實驗動物IVC籠具、PCR儀(Applied Biosystems Veriti)、Bio電泳儀、Bio凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 主要試劑

一抗Neurogranin(ab23570)、P-CaMKⅡ(phospo T286,ab50202)、PSD-95(postsynaptic density protein95，ab18258)及二抗抗兔IgG(ab28446)購于Abcam公司；醋酸鉛(LOT 20080146)購于天津市化學(xué)試劑三廠；多聚甲醛、戊二醛、硝酸(MOS純)、高氯酸(優(yōu)級純)等試劑市購。

1.4 實驗藥物

健脾解毒中藥驅(qū)鉛顆粒[4]由武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑中心制備(批號110726)。陽性對照藥物依地酸鈉鈣注射劑購于天津市氨基酸公司人民制藥廠(批號060907)。

1.5 實驗步驟

模型制作與藥物治療：將上述40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后按隨機數(shù)字表法分為2組，空白組8只飲用雙蒸水,余下32只動物為造模組，在飲水中添加0.02%醋酸鉛，連續(xù)60 d，復(fù)制大鼠慢性鉛中毒模型；第61天時將造模組動物按隨機數(shù)字表法分為4組各8只。高劑量治療組按3.0 g/(kg·d)劑量灌胃中藥(相當(dāng)于5倍成人劑量),低劑量治療組按0.6 g/(kg·d)劑量灌胃中藥(相當(dāng)于1倍成人劑量),模型組灌胃相同體積雙蒸水,陽性對照組以50 mg/(kg·d)依地酸鈉鈣加普魯卡因肌肉注射，連續(xù)注射4 d為1個療程，休息4 d后進行下1個療程，連續(xù)干預(yù)7個療程?？瞻讓φ战M10 ml/(kg·d)劑量灌胃雙蒸水,連續(xù)治療60 d。

1.6 檢測與分析

1.6.1 Morris水迷宮檢測各組動物潛伏期 水迷宮水池水位控制在平臺下1 cm，水溫保持25±1℃,平臺放置于第3象限。治療第61天時將大鼠放入不上平臺的水池中自由游泳2 min以熟悉迷宮環(huán)境，于第2天開始正式試驗。從水池4個象限的中點將大鼠放入水池，記錄大鼠自主找到平臺時間，每天4次，每次間隔15～20 min，以平均值作為當(dāng)日實驗數(shù)值，連續(xù)4 d。若在120 s內(nèi)找不到平臺，即將其引上平臺并停留10 s，其潛伏期按120 s計算。

1.6.2 樣本采集 各組動物稱重，2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后心臟采血，其中1 ml保留于已清潔的塑料試管中檢測血鉛，2 ml放入EDTA抗凝管中用于檢測HB等指標(biāo)；再快速處死動物，分離大腦海馬區(qū)組織，部分用4%多聚甲醛固定，其余置入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 血鉛檢測 微波消化法預(yù)處理全血樣本，原子吸收光譜石墨爐法測定鉛含量。

1.6.4 RT-PCR檢測海馬組織Ng、CaMKⅡα、PSD-95 mRNA表達 以Trizol提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴增，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀上進行灰度(IOD)掃描分析，利用相應(yīng)的GAPDH灰度值為參照，以與其比值表示各組各指標(biāo)mRNA表達的相對強弱。PCR擴增引物合成于上海生工公司，PSD-95：上游引物5’-CCTCTCAGGCCCCTACATCT-3’,下游引物5’-GAGGCTGGGGTACAAAGGAC-3’,產(chǎn)物長度139 bp，退火溫度58 ℃，35個循環(huán)；CaMKⅡα：上游引物5’-GGAAACAAGAAGAATGATGGCG -3’,下游引物5’-GGTCGCACATCTTCGTGTAGGA-3’,產(chǎn)物長度166 bp，退火溫度58 ℃，35個循環(huán)；Ng：上游引物5’- CACATGGCGAGGAAGAAGATAA-3’,下游引物5’- AGGGGCTCACAAACACAGTAGG -3’,產(chǎn)物長度216 bp，退火溫度58 ℃，35個循環(huán)；GAPDH：上游引物5′-GGTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3′,下游引物5′-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′，產(chǎn)物長度292 bp，退火溫度60 ℃，30個循環(huán)。

1.6.5 Western blot法檢測海馬組織Ng、P-CaMKⅡ、PSD-95蛋白表達 海馬組織樣本從液氮中取出，按1∶10(W/V)加入冰冷的勻漿液1.5 ml，電動勻漿器勻漿25次，經(jīng)4 ℃ 800×g離心10 min，取上清液分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。以牛血清白蛋白為?biāo)準(zhǔn)品，按Lowry法測定蛋白濃度。各組等量蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，以半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至NC膜上，經(jīng)3%BSA封閉后，分別加入1∶1000稀釋的Ng、P-CaMKⅡ、PSD-95抗體，4 ℃過夜。洗膜加入相應(yīng)的二抗，37 ℃反應(yīng)2 h，洗膜NBT/BCIP顯色，以內(nèi)參GAPDH含量為參照，用IPP6.0軟件對免疫印跡條帶的灰度值(光密度)進行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量與體質(zhì)量、血紅蛋白、血鉛含量比較

表1顯示，與空白對照組比較，經(jīng)60 d治療后模型組體質(zhì)量、HB顯著降低(P=0.000),血Pb含量顯著增高(P=0.000)；與模型組比較，各治療組血鉛含量顯著降低(P=0.000)，體質(zhì)量及HB顯著增高(P=0.000)；中藥高劑量組體質(zhì)量高于陽性對照組(P=0.001)和中藥低劑量組(P=0.026)。

表1 各組動物體質(zhì)量、血紅蛋白比較

注：與空白對照組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01；與陽性對照組比較：cP<0.01

2.2 各組動物Morris水迷宮實驗逃避潛伏期比較

圖1 各組動物不同時點潛伏期比較注：與空白組比較：bP<0.01；與模型組比較：cP <0.05，dP <0.01

圖1顯示，采用SPSS軟件對Morris水迷宮結(jié)果進行重復(fù)測量實驗方差分析。球形檢驗結(jié)果顯示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間存在相關(guān)性(F=27.350，P=0.000)；個體不同時間變異結(jié)果顯示有顯著性差異(F=406.483，P=0.000)，說明潛伏期有隨時間變化的趨勢；個體間變異有顯著差異(F=7.010，P=0.000)，說明各組潛伏期不同；重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用多重比較配對t檢驗(Bonferroni法)，對每個時點上4個分組數(shù)據(jù)進行兩兩比較，結(jié)果顯示隨染鉛時間增加，潛伏期顯著延長(P<0.05)；采用多元方差分析，兩兩比較每個時間點上各分組之間的差異,結(jié)果顯示不同組不同時點的潛伏期也不相同(P<0.05),說明通過強化訓(xùn)練，各組動物均獲得了一定的定位能力，但各染鉛組動物潛伏期顯著高于空白對照組(P<0.05)。

2.3 各組海馬Ng、CaMKⅡα、PSD-95 mRNA表達比較

圖2表2顯示，與空白組比較，模型組Ng、P-CaMKⅡ、PSD-95 mRNA表達均顯著降低(P=0.000)；與模型組比較,中藥高劑量組Ng、P-CaMKⅡ、PSD-95 mRNA表達均顯著增高(P=0.000)，中藥低劑量組PSD-95 mRNA表達亦顯著增高(P=0.016)；與陽性對照組比較，中藥高劑量組顯著增高(P=0.000)。

表2 各組動物海馬Ng、P-CaMKⅡ、PSD95 mRNA表達比較

注：與空白對照組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，cP<0.01；與陽性對照組比較：dP<0.01

圖2 各組動物海馬Ng、CaMKⅡα、PSD-95 mRNA表達比較注：A.空白對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.中藥低劑量組；E.中藥高劑量組

2.4 各組腦組織海馬Ng、P-CaMKⅡ、PSD-95蛋白表達比較

圖3表3顯示，與空白組比較，模型自Ng、P-CaMKⅡ、PSD-95蛋白表達顯著降低(P=0.000)；與模型組比較，陽性對照組及中藥高劑量組Ng蛋白表達顯著增高(P=0.029,0.002),中藥高劑量組P-CaMKⅡ、PSD-95蛋白表達顯著增高(P=0.000)；與陽性對照組比較，中藥高劑量組P-CaMKⅡ蛋白表達顯著增高(P=0.000)。

表3 各組動物腦組織海馬區(qū)Ng、P-CaMKⅡ、PSD-95蛋白表達比較

注：與模型組比較：aP<0.01；與空白組比較：bP<0.05，cP<0.01；與陽性對照組比較：dP<0.01

圖3 各組動物腦組織海馬Ng、P-CaMKⅡ、PSD-95蛋白表達比較

3 討論

鉛是現(xiàn)代社會中最為廣泛應(yīng)用的有色金屬之一，與人類接觸密切。鉛礦開采及冶煉、熔鉛作業(yè)、蓄電池等行業(yè)是常見的接觸鉛及其化合物的職業(yè)。0～6歲兒童由于器官發(fā)育不完善，容易受到鉛污染的毒害，引起多臟器損傷，特別是神經(jīng)系統(tǒng)不可逆?zhèn)⒂绊憙和橇Πl(fā)育[5]。鉛中毒的治療除依地酸鈉鈣為首選西藥治療外，中醫(yī)藥治療也為改善鉛中毒癥狀、控制病情、促進康復(fù)發(fā)揮了巨大作用[6-7]。

Ng是一種特異性腦突觸后蛋白，其氨基酸序列中有3個保守區(qū)域，可結(jié)合CaM也可以被突觸后蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)磷酸化，這構(gòu)成了Ng調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Ng主要分布在海馬等認知功能的腦區(qū)域，特別是海馬的CA1、CA3區(qū)以及齒狀回等區(qū)域Ng表達最高。有研究表明，Ng基因敲除后，小鼠體內(nèi)PKC、突觸后蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)下游磷酸化目標(biāo)，如核糖體S6激酶、絲裂原活化蛋白激酶、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白等明顯減少，提示在PKC和PKA介導(dǎo)的信號途徑的調(diào)節(jié)中，Ng起著關(guān)鍵作用[8-9]。另有研究證實，Ng主要通過對依賴于Ca2+的信號途徑促進作用來提高海馬LTP和學(xué)習(xí)記憶能力[10-11]。Ng是神經(jīng)元內(nèi)CaM的儲備庫，神經(jīng)元內(nèi)Ng濃度越高，形成的Ng-CaM復(fù)合體越多，當(dāng)Ca2+流入細胞內(nèi)時能形成更多的CaM-Ca2+結(jié)合，進一步激活Ca2+-CaM依賴的信號級聯(lián)反應(yīng)。Ng敲除小鼠海馬中CaM、CaMKⅡ及PKC的活性較正常小鼠顯著降低，因此Ng可能通過與CaM結(jié)合改變胞內(nèi)游離CaM的濃度，調(diào)節(jié)CaM及Ca2+/Ca依賴性蛋白酶活性而影響LTP和LTD。Ng與CaMKⅡ在LTP形成過程中關(guān)系密切，作為PKC作用的底物，Ng可以被PKC磷酸化，從而參與對LTP及認知功能的調(diào)節(jié)。Ng磷酸化可促使細胞內(nèi)活化的PKC和CaMKⅡ增加，增加的PKC和CaMKⅡ均可使N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA受體)活性增強；而NMDA受體活化又反過來促進Ng磷酸化，形成正反饋機制增強突觸傳遞，使得LTP產(chǎn)生和維持[12]。PSD-95(突觸后致密區(qū)蛋白95)是新近發(fā)現(xiàn)的一種能整合NMDA受體信號的特殊蛋白，與NMDA受體信號通路中多種相關(guān)分子結(jié)合形成信號復(fù)合體，還能影響突觸前黏附分子，發(fā)揮調(diào)節(jié)突觸狀態(tài)，維持突觸結(jié)構(gòu)的作用[13-14]。NMDA 受體參與長時程增強(LTP)，PSD-95 在LTP誘導(dǎo)過程中具有關(guān)鍵性作用[15]。

中醫(yī)學(xué)認為，鉛為外邪，由于防護不利致使鉛以煙、塵形式從胃腸、皮毛、呼吸道等侵入，主要蓄積于肝腎最終存于骨。鉛為陰寒之邪，其性濡滑墜，入內(nèi)傷絡(luò)劫陰，傷及肝腎，是生化精血機能減退或障礙，治則當(dāng)以健脾益氣解毒(4)。健脾解毒中藥驅(qū)鉛顆粒是在10多年中醫(yī)藥研究基礎(chǔ)上，根據(jù)中醫(yī)辨證論治原則組成的經(jīng)驗方[16]。方中黨參甘平，補中益氣為君；白術(shù)健脾燥濕，山藥健胃補脾，兩者合以益氣健脾為臣；炙甘草甘緩和中，柏子仁養(yǎng)心安神，黃連解毒為佐使，諸藥共奏健脾和胃、安神解毒之效。

本研究顯示，鉛通過降低Ng表達，破壞Ng-CaMKⅡ-NMDA受體之間的正反饋機制，影響突觸傳遞，引起LTP的產(chǎn)生和維持發(fā)生障礙，從而影響學(xué)習(xí)記憶能力，并通過Morris水迷宮試驗得到證實。而中藥高劑量組能糾正鉛對學(xué)習(xí)記憶能力的損害，其機制與中藥能增強Ng表達有關(guān)。健脾解毒中藥如何引起Ng表達增強還需要更進一步的研究。