GC-MS/MS測定當歸中聯(lián)苯菊酯等三種農(nóng)藥殘留的一測多評研究

朱敏鳳，余敏靈，張富東

(1.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000；2.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂山 614000)

中藥材種植及中藥飲片加工儲存過程中農(nóng)藥的不當使用，均會影響中藥材和中藥飲片質(zhì)量，嚴重危害人體健康[1]。《中國藥典》2015年版四部收載了多種有機氯類、有機磷類等農(nóng)藥殘留的檢查方法[2],近年來，對農(nóng)藥殘留量研究報道的文獻大多以氣相色譜、液相色譜或以其與質(zhì)譜的聯(lián)用為主[3-7],我們應(yīng)用GC-MS/MS法，根據(jù)色譜保留時間和質(zhì)荷比信息對樣品進行定性分析，以聯(lián)苯菊酯二級離子掃描色譜峰(181.1/166.1)面積為參照，計算它與甲氰菊酯二級離子掃描色譜峰(265.1/210.1)面積和溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰(252.9/93.0)面積的校正因子，建立應(yīng)用GC-MS/MS測定當歸[2]中聯(lián)苯菊酯等三種農(nóng)藥殘留的一測多評方法，收到了滿意的結(jié)果，現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下，以期為GC-MS/MS測定農(nóng)藥殘留量提供一測多評[8-10]研究思路。

1 材料

1.1 儀器

GCMS-TQ8030氣質(zhì)聯(lián)用儀(島津中國科技有限公司)； Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管柱，工作站為LabSolutionsGCMSSolutions 版本4.20(島津中國科技有限公司);Cleanert TPH凈化柱(天津博納艾潔爾公司)。

1.2 試藥

聯(lián)苯菊酯對照品(批號GCB05-2333-2016，100 μg/mL)，甲氰菊酯對照品(批號GCB05-2306-2016，100 μg/mL)，溴氰菊酯對照品(批號GCB05-2310-2016，100 μg/mL)均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測保護研究所。乙腈(色譜純，賽默飛科技中國有限公司)，丙酮為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鈉均為優(yōu)級純。當歸樣品由峨眉山仙山中藥飲片公司提供，按中國藥典(2015年版)鑒定為當歸(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)的根，批號為：20170109,20170322,20170625。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定原理

以聯(lián)苯菊酯為對照品測定樣品中3種農(nóng)藥殘留的原理是利用樣品色譜圖中聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的色譜峰相對保留時間進行定位[2]；二級離子碎片圖譜中聯(lián)苯菊酯在166.1、153.1、179.1有碎片離子峰(豐度比為100：5：19，以166.1為參比)，甲氰菊酯二級離子碎片圖譜中在210.1、172.1、89.0有碎片離子峰(豐度比為100：14：40，以210.1為參比)，溴氰菊酯二級離子碎片圖譜中在93.0、171.9、77.0有碎片離子峰(豐度比為100：84：22，以93.0為參比)；通過定位和二級離子碎片圖譜碎片離子峰以及其豐度比對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯色譜峰進行定性分析。在定量分析時，通過精密量取聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對照溶液，配制成不同濃度的混合溶液，按設(shè)定條件進樣，記錄色譜圖，繪制進樣量對其峰面積的回歸曲線，以聯(lián)苯菊酯回歸曲線斜率與甲氰菊酯、溴氰菊酯回歸曲線斜率的比計算校正因子(fs/k=Ks/Kk)，通過聯(lián)苯菊酯回歸曲線計算聯(lián)苯菊酯含量，通過校正因子及聯(lián)苯菊酯回歸曲線計算甲氰菊酯、溴氰菊酯含量[2]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準儲備溶液的制備

精密量取聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯標準溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備溶液(每1 mL含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯各10 μg)。

2.2.2 樣品溶液和空白溶液的制備

取當歸(20170109)約50 g，粉碎成粉末(過3號篩)，精密稱取粉末1.075 3 g，置50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，15 000 r/min勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，4 200 r/min離心5 min，取上清液于150 mL雞心瓶中，再于離心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重復(fù)勻漿提取一次，合并提取液，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm高無水硫酸鈉，用10 mL正己烷-丙酮(6∶ 4)預(yù)洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用25mL正己烷-丙酮(6∶ 4)洗脫，收集洗脫液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm濾膜過濾，即得；除稱取樣品粉末外，按上述操作制備空白溶液。

2.2.3 樣品加標溶液的制備

精密稱取當歸粉末1.021 3 g，按2.2.2項下樣品溶液的制備方法，從“置50 mL離心管中起到收集洗脫液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干”，用丙酮轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，另取標準儲備溶液1 mL置10 mL量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液5 μL至上述1 mL量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻，用0.2 μm濾膜過濾，即得。

2.3 測定條件

2.3.1 氣相條件

采用Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管柱，進樣口溫度：250℃；線速度：47.2 cm/s；程序升溫：50℃保持1 min，以25℃/min速率升至125℃，再以10℃/min速率升至300℃，保持15 min。進樣體積：1 μL。載氣：高純氦氣(>99.999%)

2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間5 min；碰撞氣氬氣(純度大于99.999%)；電離方式見表1。

表1 電離方式

2.4 圖譜解析

精密量取標準儲備溶液25 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。按2.3項下測定條件，取對照品溶液、樣品溶液、樣品加標溶液、空白溶液分別進樣，記錄色譜圖，在對照品溶液二級離子掃描色譜圖中有聯(lián)苯菊酯 (181.1/166.1)、甲氰菊酯 (265.1/210.1)和溴氰菊酯(252.9/93.0)二級離子掃描色譜峰，保留時間聯(lián)苯菊酯為17.514 min、甲氰菊酯為17.695 min、溴氰菊酯為21.783 min，在空白溶液色譜圖和樣品溶液色譜圖中沒有上述色譜峰，在樣品加標溶液色譜圖中有與對照品溶液色譜圖中保留時間一致的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯二級離子掃色譜峰，如圖1；對照品溶液和樣品加標溶液的二級離子碎片圖譜中聯(lián)苯菊酯在166.1、153.1、179.1處(豐度比為100∶ 5∶ 19，以166.1為參比)，甲氰菊酯在210.1、172.1、89.0 處(豐度比為100∶ 14∶ 40，以210.1為參比)，溴氰菊酯在93.0、171.9、77.0處 (豐度比為100∶ 84∶ 22，以93.0為參比) 均有二級離子碎片峰，如圖2。

注：A.標準品溶液;B.樣品溶液;C.樣品加標溶液;D.空白溶液1.聯(lián)苯菊酯;2甲氰菊酯;3.溴氰菊酯圖1 二級離子掃描色譜圖

注:A．聯(lián)苯菊酯二級離子碎片圖;B．甲氰菊酯二級離子碎片圖;C.溴氰菊酯二級離子碎片圖圖2 二級離子碎片圖譜

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取標準儲備溶液5、10、20、25、30、40、50 μL，分置7個5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按2.3項下方法測定，以聯(lián)苯菊酯二級離子掃描(181.1/166.1)峰面積A與聯(lián)苯菊酯進樣量m(ng)進行線性回歸，得回歸方程：A=10 388 461m-236,r=0.999 7(n=7)，進樣量在0.01～0.1 ng范圍內(nèi)與聯(lián)苯菊酯二級離子掃描峰(181.1/166.1)面積有較好的線性關(guān)系；以甲氰菊酯二級離子掃描峰(265.1/210.1)面積A與甲氰菊酯進樣量m(ng)進行線性回歸，得回歸方程：A=523 142m-283，r=0.999 6(n=7)，甲氰菊酯進樣量在0.01～0.1 ng范圍內(nèi)與甲氰菊酯二級離子掃描峰(265.1/210.1)面積A有較好的線性關(guān)系；以溴氰菊酯二級離子掃描峰(252.9/93.0)面積A與溴氰菊酯進樣量m進行線性回歸，得回歸方程：A=520 881m-144，r=0.999 5(n=7)，溴氰菊酯進樣量在0.01～0.1 ng范圍內(nèi)與溴氰菊酯二級離子掃描峰(252.9/93.0)面積有較好的線性關(guān)系。

2.6 f值和t值的計算與耐受性考察

2.6.1f值和t值的計算

甲氰菊酯與聯(lián)苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子f甲氰菊酯/聯(lián)苯菊酯=523 142/10 388 461=0.050 4，相對保留時間t甲氰菊酯/聯(lián)苯菊酯=17.695/17.514=1.010 3；溴氰菊酯與聯(lián)苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子f溴氰菊酯/聯(lián)苯菊酯=520 881/10 388 461=0.050 1，相對保留時間t溴氰菊酯/聯(lián)苯菊酯=21.783/17.514=1.243 7。

2.6.2f值的耐受性考察

實際應(yīng)用中,色譜條件可能會有一些變化,因此我們對線速度、進樣體積可能影響f值的因素進行考察,結(jié)果表明,f值的波動不大，見表2。

表2 相對校正因子耐受性考察表

2.7 精密度試驗

精密量取標準儲備溶液20 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按2.3項下測定條件重復(fù)進樣6次，測得聯(lián)苯菊酯二級離子掃描色譜峰(181.1/166.1)平均峰面積為410 877，RSD為0.6%；甲氰菊酯二級離子掃描色譜峰(265.1/210.1)平均峰面積21 099，RSD為0.7%；溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰(252.9/93.0)平均峰面積20 852，RSD為0.5%。

2.8 重復(fù)性試驗

精密量取標準儲備溶液20 μL，分別置6個5 mL量瓶，加丙酮稀釋至刻度中，搖勻。按2.3項下測定條件分別進樣，測得聯(lián)苯菊酯二級離子掃描色譜峰(181.1/166.1)平均峰面積為412 377，RSD為0.4%；甲氰菊酯二級離子掃描色譜峰(265.1/210.1)平均峰面積21 113，RSD為0.6%；溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰(252.9/93.0)平均峰面積21 088，RSD為0.5%。

2.9 樣品溶液穩(wěn)定性考察

取2.2.3項下樣品加標溶液，按2.3項下測定條件分別在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h進樣，結(jié)果聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰面積變化不大，RSD分別為1.1%、1.2%、0.9%。

2.10 檢出限與定量限

取2.2.3項下樣品加標溶液，按2.3項下測定條件測定，測得信噪比(S/N)分別為聯(lián)苯菊酯44.31、甲氰菊酯50.59、溴氰菊酯11.47，以S/N的3倍計算最低檢出限、10倍時計算最低定量限(以進樣量計),見表3。

表3 檢出限與定量限

2.11 回收率試驗

取3.1.2項下粉末9份，每份約1 g,精密稱定，分置9個50 mL離心管中，分為3組，每組3份，每組依次加標準儲備液4、5、6 μL，按2.2.2項下方法制備樣品溶液，取樣品溶液按2.3項下測定條件分別進樣，記錄圖譜; 另取聯(lián)苯菊酯對照品溶液用丙酮稀釋至每1 mL含聯(lián)苯菊酯0.01 μg、0.03 μg、0.05 μg、0.07 μg、0.10 μg的溶液，按2.3項下測定條件分別進樣，記錄色譜圖，計算聯(lián)苯菊酯二級離子掃描峰面積和進樣量間的回歸方程得：A=10 400 132m-251(n=5,r=0.999 2)，按回歸方程 A=10 400 132m-251計算供試品中聯(lián)苯菊酯含量；按校正方程A甲氰菊酯=10 400 132mf甲氰菊酯/聯(lián)苯菊酯-251計算甲氰菊酯含量，按校正方程A溴氰菊酯=10 400 132mf溴氰菊酯/聯(lián)苯菊酯-251計算甲氰菊酯含量。結(jié)果，聯(lián)苯菊酯平均回收率為93.9%，RSD為1.7%，甲氰菊酯平均回收率為93.5%，RSD為1.6%，溴氰菊酯平均回收率為93.4%，RSD為1.6%，見表4。

表4 聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.12 樣品測定

分別取三個批號當歸樣品(批號為20170109,20170322,20170625)各約50 g，粉碎成粉末(過3號篩)，分別取粉末約1 g，精密稱定，按2.2.2項下方法制備樣品溶液，取樣品溶液按2.3項下測定條件分別進樣，記錄圖譜，并按2.5項下方法計算樣品聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯殘留量，結(jié)果見表5。

表5 三批樣品含量測定結(jié)果

3 討論

當色譜條件有細微改變時，相對保留時間有細微變化，但在該試驗中，被測定物質(zhì)的定性主要采用二級離子碎片峰及其豐度比確認，所以對相對保留時間的耐受性沒有進行考察。

儀器建議進樣體積不超過1 μL，在相對校正因子f值耐受性考察時，對進樣體積0.9、1.0、1.1 μL時的f進行了比較，結(jié)果變化不大。

我們對多種藥材農(nóng)藥殘留的含量測定進行了研究，發(fā)現(xiàn)由于中藥材含有多種成分，某些成分對測定會有一些干擾，所以在測定具體某一品種時應(yīng)設(shè)計具體的試驗參數(shù)，并進行相應(yīng)方法學(xué)論證。