參苓白術(shù)散對(duì)脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸p38MAPK及TNF-α、IL-4的干預(yù)作用

賈育新，畢殿勇，段永強(qiáng)，明海霞，萬(wàn)生芳，程小麗，成映霞，呼會(huì)茹

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730020；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 100006)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis.UC)為一種臨床多見的慢性、復(fù)發(fā)性疾患，其主要表現(xiàn)為遷延、復(fù)發(fā)性的腹痛、腹瀉、里急后重，或伴有黏液膿血便等為主要臨床癥狀、體征。

潰瘍性結(jié)腸炎主要病理改變多屬累及直、結(jié)腸黏膜及黏膜下層的潰瘍性病變，部分重癥病例可發(fā)生巨結(jié)腸及穿孔等危重并發(fā)癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究觀點(diǎn)認(rèn)為引起UC的病因尚不十分確切，但機(jī)體免疫功能失調(diào)被公認(rèn)為UC的重要發(fā)病機(jī)制之一。相關(guān)研究證實(shí)炎癥遞質(zhì)包括自身相關(guān)抗體、細(xì)胞因子，氧自由基和一氧化氮、體液免疫及環(huán)氧合酶與基質(zhì)金屬蛋白酶等多個(gè)方面在UC的發(fā)病中起到重要作用，其中尤以細(xì)胞因子及其參與的免疫應(yīng)激反應(yīng)已經(jīng)成為UC發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域[1-2]。

UC歸屬中醫(yī)學(xué)“腸澼”“泄瀉”“便血”“痢疾”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾胃虛弱、濕熱蘊(yùn)結(jié)是本病的基本病機(jī)，且在脾胃虛弱的基礎(chǔ)上多伴有濕、熱、痰、瘀血、毒邪等病理產(chǎn)物，故病情遷延難愈。治療原則以健脾和胃，滲濕止瀉為主，兼顧祛除濕熱、毒瘀等邪氣[3]。故本研究選用具有益氣健脾、滲濕止瀉為主要功效的參苓白術(shù)散為主要藥物，以期探討本方對(duì)UC實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、IL-4及TNF-α基因及蛋白表達(dá)的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)體質(zhì)量(180±20)g,購(gòu)自于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)：62001000000090：SYXK[甘] 2011-0001)；實(shí)驗(yàn)設(shè)施證書編號(hào)：(SYXK[甘]2011-0001-00000118)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件：雌雄各半分籠飼養(yǎng), 室內(nèi)溫度(23±2)℃，濕度45%～55%,給予動(dòng)物滅菌標(biāo)準(zhǔn)飼料及滅菌純凈水，自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)中所需中藥飲片均購(gòu)自于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，參苓白術(shù)散藥物組成人參 、炒白術(shù)、白茯苓、薏苡仁、砂仁、蓮子、桔梗、白扁豆、山藥、陳皮、炙甘草，諸藥配伍比例5∶ 5∶ 5∶ 3∶ 3∶ 3∶ 2∶ 4∶ 2∶ 5∶ 2。藥物煎煮：首次煎煮以相當(dāng)于藥材量10倍之蒸餾水浸藥2 h，煎煮2次，共計(jì)60 min，將兩次所得中藥煎液混合，加熱濃縮至每1 mL含生藥2 g的濃度，室溫冷卻，4℃冰箱貯存。柳氮磺吡啶片購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院西藥房(SASP，上海信宜天平藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020557，0.2 g/片)；精煉豬油：安徽徽名山有機(jī)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

三硝基苯磺酸(TNBS,Sigma公司，批號(hào) SLBK1620V)；TRIzol Reagent (Invitrogen,批號(hào):15596-018)；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,批號(hào):0000123564)；RT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(Promega，批號(hào)：0000157591)；VELOCITY 18R型高速低溫離心機(jī)(伯樂公司，美國(guó))；RT-PCR儀(型號(hào)CFX96，伯樂公司，美國(guó))；PCR儀(型號(hào)S1000，伯樂公司，美國(guó))；DF110型電子分析天平；PCR所用引物：β-actin(上海生工，批號(hào)：9400969792；9400969791)；p38MAPK引物(生工公司，上海，批號(hào)9400969796；9400969797)；免疫組化p38MAPK、TNF-α、IL-4的一抗產(chǎn)地(北京博奧森生物技術(shù)有限公司p38MAPK Lot:AG07117086S；TNF-α Lot:AG09194335；IL-4 Lot:AG07042938S)；DAB顯色試劑盒(Lot:K176904D北京中杉金橋)；兔SP檢測(cè)試劑盒(Lot:K176716K北京中杉金橋)；其他：異丙醇及氯仿等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組

空白組實(shí)驗(yàn)大鼠10只，供給正常飼料、飲水。其余造模組大鼠依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]復(fù)制脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型：(1)以復(fù)合因素法復(fù)制脾虛濕困型UC大鼠模型，即造模單日給予大鼠精煉豬油灌胃(空腹,每只2 mL/d，1次/d)；(2)將實(shí)驗(yàn)大鼠置于于2 cm深的水中8 h/d使其保持站立、游泳狀態(tài)；(3)采用隔日禁食、充足飲水的造模方式,連續(xù)21 d。(4)以直徑2 mm的硅膠軟管將5%TNBS/50%乙醇的混合藥液灌入實(shí)驗(yàn)大鼠肛門8cm以上部位的結(jié)腸。造模后第3天造模大鼠出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便等癥狀，表明脾虛濕困型UC大鼠模型制作成功。根據(jù)實(shí)驗(yàn)大鼠的性別不同，按大鼠按體質(zhì)量編號(hào)，以隨機(jī)數(shù)字表法分組。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功后，將大鼠分為模型組、參苓白術(shù)散治療組(高、中、低劑量治療組)及陽(yáng)性對(duì)照組(柳氮磺胺吡啶組)，每組10只，雌雄分籠飼養(yǎng)，每籠5只。

2.2 藥物干預(yù)

空白及模型組實(shí)驗(yàn)大鼠每日以滅菌純凈水空腹灌胃,劑量：10 g/(kg·d)；參苓白術(shù)散治療組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求給予藥物干預(yù),高、中、低劑量分別為24 g/(kg·d)、12 g/(kg·d)、6 g/(kg·d)，濃煎液灌胃，每日一次；陽(yáng)性對(duì)照組給予0.2 g/(kg·d)的柳氮磺胺吡啶片劑(單位體質(zhì)量用藥劑量為60 kg成人用藥量6倍)，以純凈水充分溶解后灌胃。用藥劑量折算以人與動(dòng)物體型系數(shù)為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)[5]，各組大鼠灌胃治療均為21 d。

2.3 樣本采集及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

于末次藥物灌胃干預(yù)結(jié)束后將大鼠禁食24 h，自由飲水。測(cè)量記錄各組大鼠體質(zhì)量，烏拉坦腹腔注射麻醉(劑量：1 g/kg)，將實(shí)驗(yàn)大鼠脫頸處死。截取肛門以上8厘米處的病變結(jié)腸組織，生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，肉眼觀察評(píng)分；截取病變部位結(jié)腸組織4%多聚甲醛中固定，供病理HE染色和免疫組化檢測(cè)使用；取病變最明顯部位的結(jié)腸組織置于無(wú)酶凍存管內(nèi)，-80℃冰箱貯存用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.4 免疫組化法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織內(nèi)p38MAPK、TNF-α、IL-4的表達(dá)水平

取病變部位結(jié)腸組織以4%多聚甲醛中固定，供病理和免疫組化檢測(cè)使用。采用免疫組化SP法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠病變結(jié)腸組織內(nèi)的p38MAPK、TNF-α、IL-4的蛋白含量表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟以實(shí)驗(yàn)p38MAPK、TNF-α、IL-4的試劑盒說(shuō)明書步驟為準(zhǔn)。以胞質(zhì)(或胞核內(nèi))出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)志，每例標(biāo)本選取物鏡40倍下5個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，以出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)算出分值。圖像分析方法：以南京中醫(yī)藥大學(xué)捷達(dá)公司801病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)算平均光密度值。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織樣本p38MAPK、TNF-α、IL-4基因表達(dá)

取結(jié)腸樣本0.1 g，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度(所提取的RNA A260/A280值為1.8～2.0)符合實(shí)驗(yàn)要求，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明條件合成20 μLcDNA，RT-PCR法擴(kuò)增。β-actin，批號(hào)及引物序列：9400969790,9400969791；上游引物：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA,下游引物：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度150bp；p38MAPK，批號(hào)及引物序列：9400969798，9400969799；上游引物：AGACGAATGGAAGAGCCTGA，下游引物：GGGATGGACAGAACAGAAGC，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度：109bp；TNF-α,批號(hào)及引物序列：9400969792,9400969793；上游引物：CAGGTTCCGTCCCTCTCATA，下游引物：TGCCAGTTCCACATCTCG,產(chǎn)物片段長(zhǎng)度：100bp；IL-4，批號(hào)及引物序列：9400859829、9400859830，上游引物： GAACACCACGGAGAACGAG，下游引物：AGACCGCTGACACCTCTACA；產(chǎn)物片段：112bp。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般生存狀況

與UC造模組大鼠相比較，空白組大鼠活動(dòng)自如，飲食及二便正常，皮毛正常潤(rùn)澤；UC造模大鼠在干預(yù)后第2天，出現(xiàn)嗜睡瞇眼、毛發(fā)干枯、納差等證候，其后出現(xiàn)大便膿血、蜷臥少動(dòng)等表現(xiàn)。隨造模時(shí)間延續(xù)大鼠相繼出現(xiàn)納差懶動(dòng)、形瘦及反應(yīng)遲緩等體征。經(jīng)參苓白術(shù)散干預(yù)治療后，各藥物干預(yù)組(尤其高劑量組和柳氮磺氨吡啶組)脾虛濕困型UC大鼠的上述癥狀緩解尤其明顯，主要表現(xiàn)為UC實(shí)驗(yàn)大鼠納食漸增、體重增加、皮毛光滑、潤(rùn)澤，動(dòng)作敏捷，大便基本恢復(fù)正常形態(tài)，各項(xiàng)體征較接近正常水平。

3.2 大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、IL-4及TNF-αmRNA表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組結(jié)腸組織樣本p38MAPK、TNF-α基因表達(dá)水平較空白組升高顯著,IL-4mRNA表達(dá)水平降低明顯,實(shí)驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同模型組相比，高、中劑量的參苓白術(shù)散及柳氮磺氨吡啶均可降低大鼠結(jié)腸樣本內(nèi)p38MAPK、TNF-α基因表達(dá)水平，同時(shí)升高IL-4基因表達(dá)水平，P<0.05,P<0.01組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干預(yù)治療后，中高劑量組及西藥對(duì)照組IL-4的基因表達(dá)水平明顯升高，p38MAPK、TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著降低，治療效果以陽(yáng)性對(duì)照組及參苓白術(shù)散高劑量組最顯著，見表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、IL-4 、TNF-αmRNA表達(dá)水平的比較

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

3.3 免疫組化法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織內(nèi)p38MAPK、TNF-α、IL-4含量比較

同正常組相比，模型組IL-4蛋白的表達(dá)量明顯減小，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比較，西藥組、低組、中組、高組IL-4蛋白的表達(dá)量明顯增大，差異極顯著(P<0.01)；與西藥組相比較，低組、中組IL-4蛋白的表達(dá)量明顯減小，差異極顯著(P<0.01)；與正常組相比較，模型組p38MAPK蛋白的表達(dá)量明顯增大，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比較，西藥組、低組、中組、高組p38MAPK蛋白的表達(dá)量明顯減小，差異極顯著(P<0.01)；與西藥組相比較，低組、中組p38MAPK蛋白的表達(dá)量明顯增大，差異極顯著(P<0.01)；與正常組相比較，模型組TNF-α蛋白的表達(dá)量明顯增大，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比較，低組TNF-α蛋白的表達(dá)量明顯減小，差異顯著(P<0.05)，西藥組、中組、高組TNF-α蛋白的表達(dá)量明顯減小，差異極顯著(P<0.01)；與西藥組相比較，低組TNF-α蛋白的表達(dá)量明顯增大，差異極顯著(P<0.01),見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、IL-4 、TNF-α的含量比較

注：與空白組相比較,**P<0.01;與模型組相比較,#P<0.05,##P<0.01;與西藥組相比較,%%P<0.01

K：空白組； M：模型組D：參苓白術(shù)散組6 g/kg；Z：參苓白術(shù)散組12 g/kg；G：參苓白術(shù)散組 24 g/kg； X：柳氮磺胺吡啶0.2 g/kg圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸病理切片(HE染色,×100)

K：空白對(duì)照；M：模型對(duì)照 D：參苓白術(shù)散6 g/kg；Z：參苓白術(shù)散12 g/kg；G：參苓白術(shù)散24 g/kg；X：柳氮磺胺吡啶0.2 g/kg圖2 參苓白術(shù)散對(duì)各組脾虛濕困型UC大鼠結(jié)腸組織p38MAPK蛋白表達(dá)的影響(免疫組化，×400)

K：空白對(duì)照；M：模型對(duì)照;D：參苓白術(shù)散6 g/kg；Z：參苓白術(shù)散12 g/kg；G：參苓白術(shù)散24 g/kg；X：柳氮磺胺吡啶0.2 g/kg圖3 參苓白術(shù)散對(duì)各組脾虛濕困型UC大鼠結(jié)腸組織TNF-α蛋白表達(dá)的影響(免疫組化，×400)

K：空白對(duì)照；M：模型對(duì)照;D：參苓白術(shù)散6 g/kg；Z：參苓白術(shù)散12 g/kg；G：參苓白術(shù)散24 g/kg；X：柳氮磺胺吡啶0.2 g/kg圖4 參苓白術(shù)散對(duì)各組脾虛濕困型UC大鼠結(jié)腸組織IL-4蛋白表達(dá)的影響(免疫組化，×400)

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis.UC)屬于一種非特異性結(jié)腸潰瘍性炎病變，又可歸屬于炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)范疇。本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因機(jī)制尚不十分明確，其病變范圍局限于結(jié)腸組織黏膜及黏膜下層。本病以腹瀉、黏液膿血便及里急后重等癥為主要臨床表現(xiàn)，故當(dāng)歸屬于中醫(yī)學(xué)泄瀉、痢疾、大瘕泄等范疇[6]。中醫(yī)治療本病多采用健脾益氣、滲濕止瀉及疏肝理氣等法，代表方劑如參苓白術(shù)散、痛瀉要方等多獲良好療效[7-8]。本研究通過(guò)復(fù)制脾虛濕困型UC大鼠并施以藥物干預(yù)，以期探討具有健脾益氣、滲濕止瀉功效的參苓白術(shù)散對(duì)該型UC大鼠結(jié)腸黏膜組織細(xì)胞因子p38MAPK、TNF-α基因、蛋白表達(dá)的干預(yù)效果，以期闡明參苓白術(shù)散對(duì)UC的作用機(jī)制。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員之一，其介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、組織炎癥病變等生理和病理過(guò)程中具有重要作用。Li等的實(shí)驗(yàn)研究表明[11]，姜黃素可通過(guò)阻斷p38MPAK信號(hào)通路，抑制前炎性細(xì)胞因子(TNF-α、 IL-6)等的釋放，從而減輕結(jié)腸黏膜組織的白細(xì)胞浸潤(rùn)。其他研究證明[12]香草乙酮可以通過(guò)阻斷NOXs-ROS-p38MAPK細(xì)胞信號(hào)通路，減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，有效治療葡聚糖硫酸鈉(DSS)所導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)小鼠的結(jié)腸炎性病變,所有這些研究從側(cè)面證實(shí)p38MAPK細(xì)胞信號(hào)通路與UC的發(fā)生、發(fā)展之間具有密切的聯(lián)系。

腫瘤壞死因子(TNFα)是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞所產(chǎn)生的促炎因子，其生物學(xué)功效為參與正常炎性反應(yīng)及免疫性病理?yè)p傷，在許多病理狀態(tài)下TNF -α的表達(dá)異常增多。臨床研究表明[13-14]，實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型小鼠DSS結(jié)腸組織內(nèi)TNF-α濃度較正常小鼠體內(nèi)表達(dá)水平明顯升高，且TNF-α濃度的變化與疾病的嚴(yán)重程度、炎癥遷延復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。此外，UC實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚15]大鼠常伴肺、腸組織中TNF-α、TLR4、MIF、Mad CAM-1mRNA 等的含量表達(dá)明顯高，故可以確定TNF-α參與了UC的病變過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：模型組大鼠較空白組的一般生存情況較差，其結(jié)腸組織內(nèi)p38MAPK、TNF-αmRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。其結(jié)腸組織IL-4mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。表明p38MAPK、TNF-α表達(dá)水平升高、IL-4分泌水平降低和脾虛濕困型UC發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。造模因素可引起實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸黏膜組織炎癥因子p38MAPK、TNF-αmRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著升高，IL-4mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯減少，進(jìn)一步損傷、降低UC大鼠結(jié)腸黏膜對(duì)炎性細(xì)胞因子的免疫防御機(jī)能。同模型組比，參苓白術(shù)散中、高治療組與SASP組UC大鼠的生存狀況改善較顯著，結(jié)腸黏膜組織內(nèi)炎癥因子p38MAPK、TNF-α基因及蛋白含量表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，尤以參苓白術(shù)散高劑量組作用顯著，提示參苓白術(shù)散可通過(guò)阻斷p38MAPK信號(hào)通路，降低TNF-α的基因表達(dá)及蛋白表達(dá)水平，升高IL-4的基因表達(dá)及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而改善脾虛濕困型UC模型大鼠結(jié)腸黏膜對(duì)促炎癥因子的防御機(jī)能，抑制結(jié)腸黏膜細(xì)胞凋亡進(jìn)展，從而促進(jìn)UC模型實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸黏膜組織的炎癥修復(fù)。