蘋果酒香氣成分代謝研究進(jìn)展

楊穎迪,李 閩,彭幫柱

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

目前,我國已形成渤海灣產(chǎn)區(qū)、西北產(chǎn)區(qū)、中部產(chǎn)區(qū)三大蘋果主產(chǎn)區(qū)域,并成為世界最大的蘋果生產(chǎn)國,蘋果產(chǎn)業(yè)已成為地域性經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一。濃縮果汁是我國蘋果深加工的主打產(chǎn)品,由于國內(nèi)濃縮汁深加工開發(fā)利用力度不夠,絕大部分主要依靠出口,約占世界出口總量的60%。由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制體系不夠完善,出口貿(mào)易壁壘等問題的存在致使單一產(chǎn)品的市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)極大,這嚴(yán)重制約了我國蘋果種植業(yè)和加工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展,亟須走多元化發(fā)展之路。

蘋果富含礦物質(zhì)、維生素、多酚類等營養(yǎng)成分,對(duì)人體具有極好的功能保健作用。蘋果酒是指由蘋果或蘋果汁生產(chǎn)的一種低酒精度的發(fā)酵果酒[1]。在全世界范圍內(nèi),蘋果酒已成為產(chǎn)量僅次于葡萄酒的第二大果酒,具有較高的保健價(jià)值,有助于改善人體血液的微循環(huán),提高肝、腎及肺功能,起到預(yù)防疾病、增進(jìn)健康的作用[2-4]。目前,在國家大力提倡“糧食酒向水果酒轉(zhuǎn)變,高度酒向低度酒轉(zhuǎn)變,蒸餾酒向發(fā)酵酒轉(zhuǎn)變,普通酒向優(yōu)質(zhì)酒轉(zhuǎn)變”的產(chǎn)業(yè)政策下,蘋果酒迎來了很好的發(fā)展契機(jī)[5]。蘋果釀酒是延伸蘋果種植、加工產(chǎn)業(yè)鏈的良好途徑,且蘋果酒的發(fā)展和生產(chǎn)符合我國產(chǎn)業(yè)宏觀調(diào)控政策,能創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)效益,帶來廣泛的社會(huì)效應(yīng),這必將發(fā)展為我國蘋果深加工的又一主導(dǎo)產(chǎn)品。

1 蘋果酒主要香氣成分

蘋果酒香氣是影響蘋果酒品質(zhì)的主要因素,也是蘋果酒質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[6-7],主要是一些高級(jí)醇類、酯類、低級(jí)脂肪酸、縮醛、內(nèi)酯和萜烯等微量成分,與蘋果原料、酵母種類、發(fā)酵過程和陳釀過程等相關(guān),主要包括原料香氣、發(fā)酵香氣和陳釀香氣等。蘋果酒香氣成分復(fù)雜而含量微少,不同釀造階段,香氣成分種類和含量一直處于動(dòng)態(tài)變化之中。其中,高級(jí)醇類主要包括:2,3-丁二醇、正己醇、2-辛醇、苯乙醇、異戊醇等[6,8];羧酸類化合物主要包括:己酸、辛酸、癸酸[5];酯類化合物主要為乙酯類化合物(含量最高、最重要),如乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等[9],乙酸酯類化合物,如乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等[5,10];醛類和酮類;烯萜類化合物等[6,11-13]。

通過大量研究發(fā)現(xiàn)蘋果酒的絕大部分香氣物質(zhì)在發(fā)酵過程中形成[14-19],酵母是形成蘋果酒香氣的第一因素,發(fā)酵條件是第二因素[6-7,20];就蘋果本身的揮發(fā)性香氣成分而言,絕大多數(shù)在發(fā)酵過程中被轉(zhuǎn)化或者降解[6]。Williams等[14]用去除揮發(fā)性香氣的sweet coppin蘋果汁生產(chǎn)蘋果酒,發(fā)現(xiàn)蘋果固有的揮發(fā)性香氣成分對(duì)蘋果酒的香氣影響很小。Morton等[15]用不同品種的蘋果進(jìn)行蘋果酒發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)除金冠等有典型風(fēng)味的品種外,大部分品種蘋果的揮發(fā)性成分在加工過程中損失。于愛梅等[17]認(rèn)為不同品種蘋果的香氣物質(zhì)對(duì)蘋果酒的品質(zhì)有重要影響。汪立平[18]通過對(duì)比前人研究成果發(fā)現(xiàn),蘋果的品種不同,對(duì)蘋果酒成品香氣成分的影響程度也不同。

2 蘋果酒香氣成分分析

酒類的香氣成分分析方法有靜態(tài)頂空氣相色譜法)、動(dòng)態(tài)頂空氣相色譜法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[18]。目前多采用GC-MS技術(shù)來進(jìn)行香氣成分的定性和定量分析,此技術(shù)檢測(cè)靈敏度高,分離效果好,并且隨著儀器的不斷完善、成熟和推廣,其應(yīng)用越來越廣泛[21]。蘋果酒香氣分析前,通常要對(duì)香氣成分進(jìn)行濃縮預(yù)處理,常見的濃縮預(yù)處理方法有:蒸餾法[22]、液液萃取法[23]、固相萃取法[24]、動(dòng)態(tài)頂空技術(shù)法[25]、固相微萃取法(簡(jiǎn)稱SPME)[26]、吸附法[27]、直接進(jìn)樣法[28]等。除固相微萃取外,其他方法都是傳統(tǒng)的樣品預(yù)處理方法,都不同程度地存在某些缺點(diǎn):花費(fèi)過高,樣品量過大、耗時(shí)過長,使用的有機(jī)溶劑昂貴且有害,并可能在濃縮過程中損失香氣物質(zhì)[18]。固相微萃取作為二十世紀(jì)九十年代以來才出現(xiàn)的一種新的樣品處理方法,它幾乎改善了上述傳統(tǒng)預(yù)處理方法的所有缺點(diǎn),集采樣、濃縮、萃取、進(jìn)樣于一體,能夠盡可能地減少被分析的香氣物質(zhì)的損失,且能與GC、HPLC聯(lián)用分析[18]。

近年來,近紅外光譜分析技術(shù)憑借其快速、準(zhǔn)確、無損、方便等特點(diǎn)迅猛發(fā)展,廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)領(lǐng)域的研究[29]。由于近紅外光譜適合進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè),在釀造發(fā)酵行業(yè)也被廣泛關(guān)注[30-32]。利用近紅外光譜技術(shù)建立蘋果酒發(fā)酵過程中特征香氣的快速檢測(cè)模型,然后以此模型作為分析工具,將其應(yīng)用到蘋果酒發(fā)酵過程特征香氣生成動(dòng)力學(xué)研究范疇,可以克服蘋果酒發(fā)酵過程中傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、反饋不及時(shí)等缺陷,可為蘋果酒香氣代謝控制研究提供可行的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。已有學(xué)者采用近紅外光譜技術(shù)對(duì)酒類揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析目前的研究多集中在葡萄酒、啤酒和黃酒,在蘋果酒中的應(yīng)用尚處于研究階段[5,33]。

感官評(píng)價(jià)法是評(píng)價(jià)蘋果酒香氣的主要方法之一[34]。嗅聞法和風(fēng)味強(qiáng)度法都是基于感官評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上對(duì)香氣成分的重要性進(jìn)行評(píng)定[18]。感官評(píng)價(jià)法較為靈活,用此法對(duì)蘋果酒的風(fēng)味進(jìn)行評(píng)價(jià)可以較大程度上反映出大眾的偏好;但該方法對(duì)于評(píng)酒人員的要求較高,而且會(huì)受到評(píng)酒人員的主觀、環(huán)境等因素的影響,這在一定程度上限制了其結(jié)果的客觀性[10]。

近年來,研究學(xué)者著眼于研究與分析蘋果酒香氣質(zhì)量的客觀評(píng)價(jià)方法和體系,利用主成分分析法來建立蘋果酒香氣質(zhì)量的評(píng)價(jià)模型[35-36],對(duì)酒樣香氣組分進(jìn)行客觀的統(tǒng)計(jì)分析,豐富和完善蘋果酒的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。主成分分析是利用幾個(gè)較少的綜合指標(biāo)反映原來指標(biāo)的一種統(tǒng)計(jì)方法,將原來的指標(biāo)重新組成一組新的互相無關(guān)的幾個(gè)綜合指標(biāo)來代替原來指標(biāo),從而達(dá)到簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)和揭示變量間關(guān)系的目的[37]。主成分分析方法與感官評(píng)價(jià)無直接關(guān)系,能避免傳統(tǒng)的嗅聞法和風(fēng)味強(qiáng)度法的不穩(wěn)定性[18]。

3 主要香氣物質(zhì)的合成途徑

3.1 高級(jí)醇類化合物

高級(jí)醇類物質(zhì)的形成在發(fā)酵過程中通常有兩種途徑,一種是降解代謝途徑(Ehrlich代謝機(jī)制),一種是合成代謝途徑(Harris代謝機(jī)制)。這兩種途徑都是釀酒酵母在發(fā)酵過程中通過相應(yīng)α-酮酸的脫羧作用而實(shí)現(xiàn)的[5,38]。1907年,德國化學(xué)家Ehrlich首先提出由氨基酸形成高級(jí)醇的途徑,通過研究者在之后幾十年的不斷探索,此途徑得到修改和完善:首先氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶的作用形成α-酮酸,其氨基被轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸生成谷氨酸;然后酮酸經(jīng)酮酸脫羧酶的作用形成少一個(gè)碳原子的醛;最后醛在醇脫氫酶的作用下形成醇[38-39]。Harris于1953年研究并提出了高級(jí)醇的合成代謝途徑:葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑形成丙酮酸,丙酮酸在乙酰羥酸合酶的作用下進(jìn)入氨基酸的生物合成途徑,在合成代謝的最后階段形成α-酮酸中間體,進(jìn)一步在相應(yīng)酶的催化作用下形成相應(yīng)的高級(jí)醇[38]。

3.1.1 2-苯乙醇的合成

3.1.1.1 莽草酸途徑(Shikimate pathway) 莽草酸途徑是釀酒酵母從頭合成2-苯乙醇的代謝途徑:磷酸烯醇式丙酮酸(來源于糖酵解途徑)和4-磷酸赤蘚糖(來源于磷酸戊糖途徑)經(jīng)4步酶促反應(yīng)生成莽草酸,莽草酸經(jīng)一系列酶促反應(yīng)生成苯丙酮酸,在苯丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶作用下最終生成2-苯乙醇(圖1)[40-41]。釀酒酵母通過此途徑合成2-苯乙醇的代謝途徑長、支路多,在加上多種抑制作用的存在,合成2-苯乙醇的產(chǎn)量很低,一般僅為400～500 mg/L[41]。

圖1 酵母菌合成2-苯乙醇的代謝途徑[40]Fig.1 The metabolic pathways of 2-benzene ethanol in yeast[40]

3.1.1.2 埃爾利希途徑(Ehrlich pathway) 陳先銳等[41]綜述中提到當(dāng)培養(yǎng)基中以L-苯丙氨酸(L-Phe)作為唯一氮源時(shí),酵母菌主要通過艾氏途徑合成2-苯乙醇:經(jīng)芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ或Ⅱ的催化作用,L-Phe經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶作用生成苯丙酮酸,其氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸生成L-谷氨酸,苯丙酮酸經(jīng)苯丙酮酸脫羧酶作用生成苯乙醛,苯乙醛在醇脫氫酶作用下生成2-苯乙醇(圖2)[40]。當(dāng)培養(yǎng)基中還有其他物質(zhì)作為氮源時(shí),即使L-Phe濃度很高,也不可能完全轉(zhuǎn)化為2-苯乙醇,其中一部分L-Phe會(huì)通過其他途徑被代謝,如通過肉桂酸途徑進(jìn)入TCA循環(huán),這個(gè)降解途徑不能完全被抑制[42-43]。

圖2 艾氏途徑合成2-苯乙醇[40]Fig.2 Synthesis of 2-phenylethyl alcohol by Ehrlich pathway[40]

3.1.1.3 關(guān)鍵酶和相關(guān)基因 糖酵解途徑是微生物細(xì)胞中迄今為止研究的最為清楚透徹的代謝途徑[44]。在糖酵解途徑中以葡萄糖為起始物生成磷酸烯醇式丙酮酸共經(jīng)過了9步反應(yīng)[45]。在釀酒酵母中已經(jīng)確定有20個(gè)不同的基因和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),其中Hxt7和Hxt6為高親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;HXT7長度為570個(gè)氨基酸,具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,在高濃度葡萄糖條件下它被強(qiáng)烈壓抑[46]。

葡萄糖通過轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞后,首先在ATP和Mg2+共同參與下被己糖激酶(HK)催化,磷酸化成6-磷酸葡萄糖,這一反應(yīng)活化了葡萄糖,利于它進(jìn)一步參與合成分解代謝,同時(shí)也避免了葡萄糖逸出細(xì)胞[44]。Lagunas R和Moreno E[47]研究2-脫氧半乳糖對(duì)糖酵解的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn),2-脫氧半乳糖主要抑制己糖激酶和磷酸果糖激酶。在酵母細(xì)胞中,參與己糖磷酸化的己糖激酶有PⅠ和PⅡ,分別含有HXK1和HXK2基因[48]。葡萄糖的磷酸化,糖酵解的第一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的步驟。Williamson T[49]通過研究發(fā)現(xiàn)己糖激酶(HK)編碼基因(HXK1和HXK2)的缺失導(dǎo)致糖酵解振蕩的持續(xù)時(shí)間更長,幅度更小,而且缺失HXK2對(duì)振蕩時(shí)間的影響比HXK1更強(qiáng)。

磷酸果糖激酶長期以來一直被認(rèn)為是酵母糖酵解振蕩的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器,它是由4個(gè)由PFK1編碼的和4個(gè)由PFK2編碼的亞基組成的復(fù)雜雜異寡糖酶[49]。Williamson等[49]通過基因刪除技術(shù)分別測(cè)試了PFK1和PFK2對(duì)糖酵解振蕩的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)刪除PFK1導(dǎo)致振蕩頻率略有下降,而刪除PFK2則可完全消除振蕩。Nakajima等[50]研究發(fā)現(xiàn)除磷酸果糖激酶基因(pfkB)外,米曲霉大部分的糖酵解基因都由培養(yǎng)基中的葡萄糖誘導(dǎo)表達(dá),而在釀酒酵母中,葡萄糖的存在會(huì)誘導(dǎo)PFK1和PFK2的表達(dá);他們還發(fā)現(xiàn)米曲霉磷酸果糖激酶的兩個(gè)多肽和釀酒酵母的多肽相比,其N-端大約少200個(gè)氨基酸。

Gap1p是轉(zhuǎn)運(yùn)芳香族氨基酸進(jìn)入細(xì)胞的主要通透酶。培養(yǎng)基中存在優(yōu)質(zhì)氮源(如谷氨酰胺和氨)時(shí),由于氮代謝物阻遏作用,GAP1的表達(dá)被抑制,質(zhì)膜上的Gap1p失活;當(dāng)培養(yǎng)基僅有貧乏氮源(如脯氨酸、尿素和芳香族氨基酸)時(shí),GAP1被誘導(dǎo)表達(dá),Gap1p恢復(fù)轉(zhuǎn)運(yùn)活性。當(dāng)L-Phe為唯一氮源時(shí),Ssy1p首先接受L-Phe的信號(hào),并誘導(dǎo)GAP1表達(dá)和Gap1p恢復(fù)活性,Gap1p將L-Phe轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi),參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)[41]。

在釀酒酵母中存在兩種同工酶,即芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ和Ⅱ,兩者同屬于第一家族氨基轉(zhuǎn)移酶類,分別由ARO8和ARO9基因編碼。Aro8p能夠催化與芳香族氨基酸代謝相關(guān)的絕大部分轉(zhuǎn)氨反應(yīng),而且對(duì)甲硫氨酸、α-氨基己二酸和亮氨酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)也有催化作用。在優(yōu)質(zhì)氮源條件下細(xì)胞不表達(dá)ARO9基因,在僅含貧乏氮源或者ARO8基因無法表達(dá)的情況下,ARO9經(jīng)苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá),產(chǎn)生芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶II[41]。

釀酒酵母基因組中含有5個(gè)可能編碼苯丙酮酸脫羧酶活性的基因,只有ARO10基因在不同氮源的條件下的轉(zhuǎn)錄水平有較大改變,當(dāng)以L-Phe為唯一氮源時(shí),艾氏途徑中苯丙酮酸脫羧酶主要是由ARO10基因編碼;Aro10p的底物范圍較廣,主要參與芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨反應(yīng)產(chǎn)物的脫羧反應(yīng)[41,51]。

在釀酒酵母中共發(fā)現(xiàn)6個(gè)脫氫酶基因與2-苯乙醇的合成相關(guān),其中ADH1、ADH2、ADH3、ADH4和ADH5這5個(gè)為乙醇脫氫酶基因,SFA1為甲醛脫氫酶基因,Adh1p-Adh5p或者Sfa1p任何一種酶都可以獨(dú)自完成艾氏途徑中最后一步由醛脫氫形成高級(jí)醇的催化反應(yīng)[52]。

3.1.2 異戊醇的合成 異戊醇主要經(jīng)由Ehrlich途徑合成,原料中的蛋白質(zhì)、氨基酸在酵母分泌的轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶和醇脫氫酶的作用下可分解產(chǎn)生異戊醇[53]。Atsumi等[54]利用13C核磁共振波譜法和氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行試驗(yàn),最早報(bào)道了異戊醇可以通過亮氨酸代謝得到,且這個(gè)代謝過程中關(guān)鍵的丙酮酸脫羧酶由釀酒酵母的YDL080c基因編碼。該方法合成異戊醇的優(yōu)點(diǎn)是利用蛋白質(zhì)等非糖類物質(zhì)作為原料進(jìn)行發(fā)酵,可以提高原料的利用范圍;缺點(diǎn)是產(chǎn)物少而復(fù)雜,難以有效分離,不利于大規(guī)模生產(chǎn)[53]。

3.2 羧酸類化合物的合成

揮發(fā)性脂肪酸主要來源于酒精發(fā)酵過程,Blochh和Lynen最早發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A與脂肪酸代謝有關(guān)。在酵母代謝過程中,乙酰輔酶A與丙二酰輔酶A發(fā)生反應(yīng),主要生成偶數(shù)直鏈飽和脂肪酸類化合物(含有4～18個(gè)碳原子),而其他一些含量較少的不飽和脂肪酸和奇數(shù)碳原子的脂肪酸,其合成與否受發(fā)酵條件的影響[5,55]。

相關(guān)研究表明,釀酒酵母細(xì)胞產(chǎn)生乙酰輔酶A最主要的代謝途徑有兩個(gè):a、丙酮酸代謝支路,又稱酮酸代謝旁路,丙酮酸經(jīng)過丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)、乙酰輔酶A合成酶(ACS)的催化作用形成乙酰輔酶A;b、丙酮酸脫氫酶途徑,在有氧和線粒體存在條件下,丙酮酸經(jīng)過丙酮酸脫氫酶復(fù)合酶(丙酮酸脫氫酶E1、二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶E2、二氫硫辛酰胺脫氫酶E3)催化作用,發(fā)生氧化脫羧反應(yīng)形成乙酰輔酶A[56-57]。釀酒酵母中乙酰輔酶A主要源于丙酮酸代謝旁路,其中編碼乙酰輔酶A合成酶的結(jié)構(gòu)基因有兩個(gè):ACS1和ACS2,ACS1對(duì)非葡萄糖碳源的代謝具有非常重要的作用,而在缺氧和葡萄糖濃度過高時(shí)，表達(dá)會(huì)受到明顯抑制;ACS2是釀酒酵母以葡萄糖為碳源進(jìn)行生長和繁殖所必需的基因,在細(xì)胞內(nèi)為組成型表達(dá)[58]。釀酒酵母細(xì)胞中主要由乙酰輔酶A水解酶催化乙酰輔酶A的降解過程,此過程受到葡萄糖的抑制[59]。

乙酰輔酶A羧化酶(ACC)在脂肪酸合成和代謝過程中起著重要作用,能夠催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A,這是脂肪酸合成代謝的第一步反應(yīng),也是限速反應(yīng)[60]。丙二酸單酰輔酶A是長鏈脂肪酸合成的重要底物,在脂肪酸的合成中作為C2單位的供體,并且在脂肪酸的氧化中作為線粒體穿梭系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子[61]。對(duì)于大多數(shù)生物來說ACC是一個(gè)必需酶,缺少ACC對(duì)酵母的生物組織來說是致命的,而脂肪酸合酶(FAS)的缺失不會(huì)造成致死影響,只要在培養(yǎng)基中添加必需脂肪酸便可繼續(xù)存活[60]。ACC分為兩大類:第一大類為異質(zhì)型ACC,即多亞基型,存在于細(xì)菌、大多數(shù)植物(不包括禾本植物)的質(zhì)體中,大腸桿菌的ACC是第一類中的典型代表;第二大類ACC為同質(zhì)型ACC,即多功能型,大多數(shù)植物的胞質(zhì)溶膠、人類和大多數(shù)真核生物的ACC屬于這一類[60]。目前僅有研究動(dòng)物[60,62]、植物[63]體內(nèi)與ACC相關(guān)基因的報(bào)道,而微生物體內(nèi)與ACC相關(guān)基因的研究尚未見報(bào)道。

3.3 酯類化合物的合成

國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)酯類化合物的形成途徑有兩條:一條是酸和醇類化合物在酯酶的催化下脫水縮合形成酯,此途徑發(fā)生于酒的陳釀期,反應(yīng)極其緩慢,如酒石酸乙酯、琥珀酸乙酯等的生成,另一條是酰基輔酶A在醇?；D(zhuǎn)移酶(AATFase)的作用下和相應(yīng)的醇類化合物化合形成酯,此為酒中酯類化合物形成的主要途徑,如常見的乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯等[64-68]。esterase和lipase都屬于酯酶,既能合成酯類化合物又能水解酯類化合物,其中esterase催化短鏈脂肪酸合成酯,而lipase催化中長鏈脂肪酸合成酯[64,68]。

郭建華等[69]研究發(fā)現(xiàn)在白酒酒醅發(fā)酵過程中,酶的種類和酯類物質(zhì)的生成具有重要的相關(guān)性:總酯的生成與糖化酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶相關(guān)性顯著,其中脂肪酶與乙酸乙酯的生成顯著相關(guān),糖化酶和脂肪酶與乳酸乙酯的生成顯著相關(guān)。

3.3.1 乙酯類的合成 乙醇和短鏈或中鏈脂肪酸可作為乙酯類化合物的合成底物。在酒精發(fā)酵過程中,通過細(xì)胞質(zhì)中脂肪酸合成酶復(fù)合體的作用,酵母細(xì)胞中的短鏈和中鏈脂肪酸被釋放出來,并在酰基轉(zhuǎn)移酶(acyltransferase)的催化作用下和乙醇生成相應(yīng)的乙酯類化合物[70]。酵母中催化乙酯合成的酰基轉(zhuǎn)移酶主要是乙醇?；D(zhuǎn)移酶(Eeb1)和乙醇己酰轉(zhuǎn)移酶(Eht1),分別由EEB1和EHT1基因編碼。其中Eeb 1在乙基酯的合成中起主要作用,而Eht1則主要催化乙醇和己酰輔酶A生成己酸乙酯。研究者研究發(fā)現(xiàn)Eeb1和Eht1的過量表達(dá)并沒有使乙基酯的含量明顯增加,表明Eeb1和Eht1并不是乙基酯合成的限速酶[70-71]。

3.3.2 乙酸酯類的合成 在酵母細(xì)胞內(nèi),乙酸酯的合成底物是乙醇或高級(jí)醇和?；o酶A(acyl coenzyme A,acyl-CoA),它們?cè)诖家阴；D(zhuǎn)移酶(AATase)的催化作用下生成相應(yīng)的乙酸酯。酵母細(xì)胞內(nèi)的醇乙?；D(zhuǎn)移酶有Atf1、Lg-Atf1和Atf2,三者的編碼基因分別為ATF1、Lg-ATF1和ATF2,其中Atf1和Atf2在釀酒酵母和巴氏酵母中都存在,而Lg-Atf1只在巴氏酵母中存在[70,72]。在這些酶中,Atf1對(duì)于乙酸酯的合成最為重要,在發(fā)酵過程中,通過調(diào)控ATF1的表達(dá),乙酸酯的生成量變化明顯[73]。氧氣和不飽和脂肪酸均有抑制酵母中醇?；D(zhuǎn)移酶活性的作用,其中不飽和脂肪酸可以不受氧氣的影響單獨(dú)調(diào)控ATF1基因的轉(zhuǎn)錄[74],棕櫚油酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸均具有此調(diào)控作用[74-75]。也有研究表明,酵母細(xì)胞中的酯酶也與乙酸酯的合成有關(guān),其編碼基因是IAH1;此外,酯酶還可水解乙酸酯,且其水解乙酸酯的速率明顯高于合成乙酸酯的速率[70]。

4 展望

蘋果酒香氣成分復(fù)雜,每種香氣都會(huì)對(duì)蘋果酒總體香氣產(chǎn)生不同程度的影響,但是具有高香氣活性值(Odor activity value,OAV)的關(guān)鍵香氣成分主要決定著蘋果酒香氣的風(fēng)格和特征,這些關(guān)鍵特征香氣成分或其前體物質(zhì)主要在發(fā)酵過程中生成,因此加強(qiáng)蘋果酒發(fā)酵過程中關(guān)鍵特征香氣的生成機(jī)制與控制方法的研究尤為必要。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)和代謝組學(xué)的高速發(fā)展,果酒的香氣分析和評(píng)價(jià)方法已經(jīng)逐漸成熟,蘋果酒的香氣代謝研究目前已經(jīng)成為熱門的研究課題。高級(jí)醇、酯類是影響蘋果酒風(fēng)味的主要成分,但從研究者們對(duì)蘋果酒香氣物質(zhì)的影響因素和代謝途徑研究來看,主要集中在醇類物質(zhì)的研究上。目前代謝途徑研究的較為透徹的是2-苯乙醇,其次是異戊醇,對(duì)于其他的醇類物質(zhì)的代謝途徑研究還處于探索階段,對(duì)于蘋果酒中酯類、羧酸類等其他物質(zhì)的研究很少。今后要對(duì)我國蘋果酒的關(guān)鍵香氣成分及其代謝機(jī)理繼續(xù)進(jìn)行探索;通過開展更加深入的釀酒酵母代謝過程的研究,找到其代謝過程中的關(guān)鍵酶類和相關(guān)基因,并通過基因工程等技術(shù)改良酵母的釀酒特性,找到其合成過程的中間產(chǎn)物及酶類、探明其代謝機(jī)制,以便更好地控制蘋果酒香氣形成,生產(chǎn)出符合消費(fèi)者需求的各類香氣風(fēng)格的蘋果酒。