白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠生長性能 及肝臟糖脂代謝、能量代謝的影響

李 毅,夏振海,魏思宇,陳璟玥,陳安格,李自強,陳佳翎,余嘉瑤,王 恬,鐘 翔

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

肥胖已經(jīng)成為一種常見的慢性疾病,在中國已經(jīng)上升為社會問題。2017年最新健康調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,中國人的肥胖率已經(jīng)達到17%。不同于歐美國家,中國式肥胖主要表現(xiàn)為腹部脂肪堆積,極易引起非酒精性脂肪肝、糖代謝異常、脂代謝紊亂、高血壓、嘌呤代謝異常等疾病,嚴重影響到人們的日常生活,甚至?xí)诒碛^遺傳的作用機制下對后代產(chǎn)生影響。植物提取物作為一種天然、無污染的食品添加劑,在防治肥胖方面具有不良反應(yīng)少、易于被大眾接受等特點。有國外研究者曾從400多種植物中篩選出了44種能夠抑制脂肪細胞脂質(zhì)積累的粗提取物,其中葛根草、覆盆子、山茱萸提取物和尼泊爾老鸛草4種提取物具有顯著活性,表現(xiàn)出高的脂肪抑制性,對肥胖具有高的治療意義[1]。國內(nèi)研究者也發(fā)現(xiàn)蕎麥、余甘子等植物提取物在防治非酒精性脂肪肝、調(diào)控脂代謝方面具有積極的效果[2-3]。

白藜蘆醇(Resveratrol)是一種主要存在于虎杖、葡萄、藜蘆、花生等植物中的多酚類化合物。相關(guān)研究表明,白藜蘆醇具有抗氧化、抗炎癥、抗心血管疾病、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等一系列功效[4-5]。Baur等[6]研究表明,口服白藜蘆醇可以安全地減少小鼠過量熱量攝入導(dǎo)致的許多負面后果，如線粒體數(shù)量減少，并且能夠調(diào)節(jié)已知的長壽途徑，總體上改善健康和生存。Jeon等[7]研究表明,白藜蘆醇能夠起到緩解與肥胖有關(guān)的外周和中樞炎癥和代謝紊亂,并且改善高脂日糧(HFD)喂養(yǎng)的糖尿病小鼠記憶缺陷的功能。宋昱等[8]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇對長期高脂日糧抑制的FoxO3a、catalase和MnSOD基因通路起到了積極的作用,從而改善高脂日糧誘導(dǎo)的氧化還原失衡。目前,對于白藜蘆醇防治肥胖的研究主要集中在脂代謝方面,有關(guān)糖代謝和能量代謝的研究較少。本文通過探究白藜蘆醇對高脂日糧誘導(dǎo)的肥胖小鼠生長性能、肝臟的脂質(zhì)代謝、糖代謝和能量代謝等代謝指標及相關(guān)基因的表達,以期為與白藜蘆醇的有關(guān)保健產(chǎn)品與食品的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所有日糧 南通特洛菲飼料科技有限公司,日糧配比參考AIN93標準[9]。LFD組飼喂TP 2330055MC飼料,原料包括酪蛋白、淀粉、糊精、蔗糖、豆油、礦物質(zhì)混合物、維生素混合物、胱氨酸、膽堿、TBHQ(抗氧化劑)。低脂日糧,脂肪含量為10%;HFD組飼喂TP 2330055M飼料,原料包括酪蛋白、淀粉、蔗糖、豬油、礦物質(zhì)混合物、維生素混合物、胱氨酸、膽堿、TBHQ。高脂日糧,脂肪含量為60%。

Bio-Gen Series PRO 200勻漿機 美國PRO Scientific公司;5804R型臺式高速冷凍離心機 德國 Eppendorf公司;Thermo Nano Drop 2000 超微量可見光分光光度、QuantStudio 5 Real-Time PCR 儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗動物分組 40只健康的C57BL/6J雄性小鼠,預(yù)實驗3周,按照體重隨機分成4組,每組10只,分別為低脂日糧組(LFD)、低脂日糧+276 mg/kg白藜蘆醇組(LR)、高脂日糧組(HFD)、高脂日糧+400 mg/kg白藜蘆醇組(HR)[8，10]。低脂飼料熱量:3.6 kcal/g,其中,脂肪熱量10%,蛋白質(zhì)熱量14%,碳水化合物熱量76%。高脂飼料熱量:5.2 kcal/g,其中,脂肪熱量60%,蛋白質(zhì)熱量14%,碳水化合物熱量26%。即HR組白藜蘆醇的添加量為0.04%條件下,LR組白藜蘆醇的添加量為0.0276%,此時相同采食熱量情況下,LR和HR組小鼠白藜蘆醇含量相同。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 所有小鼠于環(huán)境衛(wèi)生良好的鼠房中同室分籠飼養(yǎng),預(yù)飼養(yǎng)3周,正式試驗為12周,小鼠自由采食和飲水,打耳標作標記。每天12 h/12 h光暗周期,室內(nèi)溫度維持在(23±2) ℃,濕度50%～60%。每2 d更換一次飼料,記錄相應(yīng)采食量,每周稱重一次。

1.2.3 樣品的采集 飼喂12周后,小鼠空腹24 h,稱重,乙醚麻醉,摘眼球取血0.5～1 mL,頸椎脫臼處理小鼠,迅速取出肝臟置于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗,濾紙擦干后置于液氮中,然后放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.4 生長性能指標的測定 試驗期間,每周稱重,精確到0.01 g;每2 d更換飼料,記錄采食量,計算日均采食量。

1.2.5 血清指標的測定 眼球取血置于1.5 mL無菌試管中,室溫靜置15 min,在4 ℃,3500 r/min條件下離心10 min,取上清,測定AST和ALT的活力,測定步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 肝臟中相關(guān)代謝指標的測定 于-80 ℃冰箱取出200 mg肝臟組織,按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)為1∶9的比例,在冰浴條件下使用相應(yīng)的勻漿介質(zhì)進行機械勻漿,于4 ℃、3500 r/min條件下離心10 min,取上清待測。在高脂模型條件下,采用無水乙醇為勻漿介質(zhì)測定LPO和MDA,采用生理鹽水為勻漿介質(zhì)測定AST、ALT、Cu/Zu-SOD、HK、PK、SDH和MDH的酶活力,測定步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

需求情況：氮肥方面，尿素處于農(nóng)業(yè)需求淡季，各地基本無農(nóng)作物用肥需求；工業(yè)需求方面，膠板廠受大氣污染治理影響，開工率無上升，復(fù)合肥企業(yè)開工率下滑，對尿素的采購需求減少。磷肥方面，國內(nèi)冬儲市場逐步展開，西北、東北市場到貨量少，華北市場交投清淡；出口市場已接近收尾，部分企業(yè)仍有出口訂單待發(fā)。鉀肥方面，復(fù)合肥企業(yè)開工率下降，對鉀肥的采購需求減少。復(fù)合肥方面，南方經(jīng)濟作物用肥需求減少，北方地區(qū)農(nóng)業(yè)需求結(jié)束，冬儲備肥預(yù)收為主，鋪貨不順暢。

1.2.7 肝臟RNA的提取和mRNA表達量的測定 于-80 ℃冰箱取出100～200 mg凍存的肝臟樣品,加入1 mL預(yù)冷的Trizol溶液,用美國MP FastPrep-24勻漿機勻漿,冰上靜置5 min,加入200 μL氯仿振蕩混勻后,置于冰上靜置3 min,4 ℃、12000 g/min條件下離心15 min,取上清置于新的滅菌管中,并加入等體積的異丙醇沉淀核酸,-20 ℃靜置30 min后,4 ℃、12000 g/min條件下離心10 min,棄上清,底部白色沉淀即是RNA,用75%的酒精洗滌沉淀2～3次,超凈臺晾干,加適量的無RNA酶的水溶解沉淀。采用Thermo Nano Drop 2000超微量可見光分光光度計測定RNA的濃度和純度,10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用無RNA酶的水稀釋到1000 ng/μL,采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,所得20 μL的cDNA樣品保存于-20 ℃待測。

mRNA表達量按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix定量說明書進行測定。20 μL反應(yīng)體系如下:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上游引物(10 μmol/L)0.4 μL,下游引物(10 μmol/L)0.4 μL,cDNA x μL,加ddH2O補充到20 μL。試驗按照以下條件進行qPCR反應(yīng):預(yù)變性:95 ℃,30 s;40個循環(huán)反應(yīng):95 ℃,10 s;65 ℃,30 s;溶解曲線:95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,15 s。試驗結(jié)果以2-ΔΔCt來表示,內(nèi)參基因為GAPDH。

本試驗所用基因引物均由上海生工生物工程有限公司提供,引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析,首先采用一般線性模型(General liner model,GLM)進行主效應(yīng)(日糧和白藜蘆醇)及互作效應(yīng)的差異顯著性檢驗。采用單因素方差分析,Duncan’s進行多重比較,結(jié)果用平均值±標準差表示,p<0.01表示差異極顯著,p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠生長性能的影響

由表2可知,試驗期間各試驗組小鼠的體重均逐步增長。試驗12周HFD小鼠的體重比LFD小鼠提高了28.24%(p<0.05),建模成功。與LFD小鼠相比,HFD小鼠平均體重在第4周、第8周和第12周分別顯著增加了9.58%、16.94%、28.24%(p<0.05),說明在高脂日糧的條件下,HFD小鼠的體重遠超于LFD小鼠,并與時間成正相關(guān)。與HFD小鼠相比,HR小鼠體重在試驗8周和12周時分別降低了6.95%和10.71%(p<0.05),說明添加白藜蘆醇能有效的緩解體重的增加。

表2 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠體重的影響(g)Table 2 Effect of resveratrol on weight of mice fed with high fat diet(g)

由表3可知,與LFD小鼠相比,HFD小鼠日均采食量在試驗前4周和4～8周分別顯著降低15.57%、9.48%(p<0.05),說明高脂日糧中能量較高,適口性低,小鼠采食量減少。在日糧中添加了白藜蘆醇,與HFD小鼠相比,HR小鼠的日均采食量在試驗前4周和4～8周分別顯著提高了6.13%、19.10%(p<0.05);與LFD小鼠相比,LR小鼠的日均采食量在試驗前4周、4～8周和后4周分別顯著提高了24.04%、36.00%、29.66%(p<0.05),說明在高脂日糧和低脂日糧條件下,白藜蘆醇均有提高適口性的作用。

表3 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠日均采食量的影響(g/d)Table 3 Effect of resveratrol on average daily feed intake of mice fed with high fat diet(g/d)

本研究發(fā)現(xiàn),由于受到高脂日糧的影響,小鼠的體重顯著增加(p<0.05),與時間成正相關(guān),但相應(yīng)的小鼠的采食量顯著減少(p<0.05),可能由于高脂飼料脂肪含量太高,過于油膩,影響適口性。在高脂日糧中添加了白藜蘆醇以后,小鼠的體重顯著下降(p<0.05),采食量有所增加,但不顯著(p>0.05)。宋昱等[8]研究表明,分別飼喂C57BL/6J雄性小鼠白藜蘆醇添加量為0.04%和0.08%的高脂日糧12周,小鼠的體重顯著下降,采食量無顯著變化,其中添加0.04%的白藜蘆醇的作用效果優(yōu)于0.08%,與本試驗研究結(jié)果一致。Ku等[11]研究表明,給SD大鼠每天灌胃10 mg/kg·BW 5周,大鼠的體重明顯減輕。本試驗研究還發(fā)現(xiàn)在低脂條件下,白藜蘆醇的飼喂能夠顯著提高采食量(p<0.05),提示白藜蘆醇可能有提高適口性的作用。

2.2 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠相關(guān)代謝的影響

2.2.1 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠血清和肝臟中AST、ALT活力的影響 由表4可知,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠血清中AST和ALT活力分別顯著提高了57.51%和201.63%(p<0.05),肝臟中AST和ALT活力分別顯著降低了24.50%和19.21%(p<0.05),說明肥胖對肝臟造成了損傷,導(dǎo)致血清中AST和ALT升高。與HFD組小鼠相比,HR組小鼠血清中AST和ALT活力分別顯著降低了16.06%和62.87%(p<0.05);HR組小鼠肝臟中AST和ALT活力分別顯著升高了31.70%和12.81%(p<0.05),說明白藜蘆醇對肥胖引起的肝臟損傷起到緩解作用。

表4 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠血清和肝臟AST、ALT活力的影響Table 4 Effect of resveratrol on the activities of aspartateaminotransferase(AST)and alaninetransaminase(ALT) in the serum and liver of mice fed with high fat diet

AST和ALT是衡量機體肝臟損傷的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn),由于受到高脂日糧的影響,小鼠的血清中AST和ALT活力顯著提高(p<0.05),肝臟中AST和ALT活力有所下降,說明肥胖可能造成機體肝臟損傷。高脂日糧中添加了白藜蘆醇以后,小鼠的血清中AST、ALT均顯著減少(p<0.05),肝臟中AST、ALT均有所升高,提示白藜蘆醇可以緩解肥胖造成的肝臟損傷。段勝紅等[12]研究表明,通過每天灌胃100、50、25 mg/kg三個劑量的白藜蘆醇,高脂模型SD大鼠血清中的AST和ALT都顯著減少(p<0.05),與本試驗研究結(jié)果一致。Hussein等[13]的研究同樣發(fā)現(xiàn),飼喂白藜蘆醇能夠有效緩解雌性老鼠的肝臟損傷,降低血清中AST和ALT。

2.2.2 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟中LPO、MDA、Cu/Zn-SOD的影響 由表5可知,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠肝臟中LPO和MDA含量分別升高了36.82%和76.25%(p<0.05)。與HFD組小鼠相比,HR組小鼠肝臟中LPO和MDA含量分別顯著降低了15.72%和26.95%(p<0.05),以上結(jié)果說明,白藜蘆醇對肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)起了正調(diào)控的作用。

表5 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟中LPO、MDA、Cu/Zn-SOD的影響Table 5 Effect of resveratrol on the activities of lipid peroxidation assay,MDA and Cu/Zn superoxide dismutase in the liver of mice fed with high fat diet

2.2.3 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟糖代謝及能量代謝關(guān)鍵酶及相關(guān)基因表達量的影響 由表6可知,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠肝臟中HK、PK、SDH和MDH活力分別降低了15.23%、37.73%、27.28%和16.38%(p<0.05)。在日糧中添加了白藜蘆醇,與HFD組小鼠相比,HR組小鼠肝臟中HK、PK、SDH和MDH活力分別升高了34.56%、85.98%、16.04%和18.70%(p<0.05)。以上結(jié)果說明,高脂日糧模型會導(dǎo)致小鼠肝臟糖酵解速度減慢,三羧酸循環(huán)減弱,白藜蘆醇的添加能激活相關(guān)酶活性。

表6 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟糖代謝及能量代謝關(guān)鍵酶的影響Table 6 Effect of resveratrol on the glucose metabolism and key enzymes of energy metabolism in the liver of mice fed with high fat diet

由表7可知,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠肝臟中MDH1、Sdha和PGC-1αmRNA相對表達量分別顯著降低了15.90%、32.00%和28.2%(p<0.05);在日糧中添加了白藜蘆醇,與HFD組小鼠相比,HR組小鼠肝臟中Hk2、Pkm、Cs、MDH1和SdhamRNA相對表達量分別顯著升高了94.13%、34.70%、17.99%、41.26%和50.59%(p<0.05),以上結(jié)果說明白藜蘆醇對肥胖小鼠肝臟糖代謝和能量代謝相關(guān)基因表達量影響明顯,起了積極作用。

表7 白藜蘆醇對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟代謝相關(guān)基因表達量的影響Table 7 Effect of resveratrol on the metabolic related gene expression in the liver of mice fed with high fat diet

肥胖不僅會導(dǎo)致脂代謝紊亂,還會引起糖代謝異常等慢性疾病。HK和PK是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,MDH、SDH和CS是三羧酸循環(huán)途徑的關(guān)鍵酶。在饑餓的條件下,體內(nèi)HK活性升高,催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖在一系列催化作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸,在PK的催化作用下生成丙酮酸,從而參與三羧酸循環(huán)[16-17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),高脂日糧造成小鼠肝臟的HK和PK活性減弱,與Hk2、Pkm mRNA表達量的變化趨勢一致,但都差異不顯著(p>0.05)。高脂日糧中添加了白藜蘆醇以后,小鼠肝臟的HK和PK活性均顯著的升高(p<0.05),對應(yīng)Hk2和Pkm mRNA表達量也顯著升高(p<0.05),提示白藜蘆醇能夠緩解肥胖對糖酵解途徑的抑制作用,通過增加脂肪酸的β氧化途徑,減少脂肪的生成,從而提高糖酵解作用。Cui等[18]研究表明,飼喂高脂日糧的C57BL/6J小鼠的PGC-1α和Hk2 mRNA表達量著低于低脂日糧組,飼喂木蘭提取物BL153這種植物提取物能提高Hk2 mRNA表達量,緩解肥胖造成的腎臟損傷,與本研究結(jié)果相似,說明Hk2受到肥胖的影響表達量降低,而植物提取物對其有積極的作用。Wu等[19]研究表明,敲除Hk2,心肝中的活性氧水平顯著提高(p<0.05),揭示了能夠通過調(diào)節(jié)線粒體的通透性來減少活性氧的產(chǎn)生,從而緩解心肌肥大,說明Hk2與線粒體代謝有關(guān)。本研究通過白藜蘆醇調(diào)控高脂小鼠Hk2表達量,影響線粒體循環(huán)。

SDH是三羧酸循環(huán)中第一個脫氫酶,催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,其活力大小直接反映線粒體三羧酸循環(huán)的強弱[20]。MDH存在于線粒體基質(zhì)中,是三羧酸循環(huán)中重要的氧化還原酶,可將草酰乙酸還原成蘋果酸,也能催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸或者生成丙酮酸,為機體脂肪合成提供了重要的輔酶NADPH[21]。檸檬酸合成酶(citroyl synthetase,CS)催化三羧酸循環(huán)中乙酰輔酶A和草酰乙酸縮合成檸檬酸,是調(diào)控機體三羧酸循環(huán)的又一重要酶[22]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),由于受到高脂日糧的影響,小鼠肝臟的SDH和MDH活性減弱,MDH1、Sdha和PGC-1αmRNA表達量也顯著降低(p<0.05)。高脂日糧中添加了白藜蘆醇以后,小鼠肝臟的SDH和MDH活性升高,Cs、MDH1和SdhamRNA表達量也顯著升高(p<0.05),提示白藜蘆醇能夠提高線粒體三羧酸循環(huán)活性,緩解肥胖的線粒體損傷。Desquiret-Dumas V 等[23]研究表明,白藜蘆醇能夠激活肝細胞中線粒體NADH脫氫酶活性,提高NAD/NADH比率,起到調(diào)節(jié)能量代謝的作用。Ma等[24]研究表明,白藜蘆醇能夠通過下調(diào)HIF-1α的表達,減少線粒體活性氧的產(chǎn)生,從而緩解機體非酒精性脂肪肝,Fang等[25]研究表明,白藜蘆醇能夠作為SIRT1的激動劑,通過提高SIRT1的活性,增加PGC-1α的去乙?；瘉硖岣呔€粒體功能,從而改善糖尿病高糖引起的心肌氧化應(yīng)激,線粒體功能障礙和心肌纖維化。上述研究與本文研究類似,提示白藜蘆醇能夠通過提高線粒體相關(guān)代謝酶活性、調(diào)控膜通透性減少活性氧產(chǎn)生等途徑來調(diào)控肥胖小鼠肝臟損傷。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,高脂日糧模型提高了血清中AST、ALT,增加了肝臟中LPO、MDA的含量,減少了肝臟中SOD、HK、PK、SDH和MDH的活力,相應(yīng)的mRNA表達量也發(fā)生了一致的變化,對機體造成了損傷,引發(fā)代謝紊亂。添加了0.04%的白藜蘆醇后,相對應(yīng)的指標均得到了一定程度的改善。以上結(jié)果表明:白藜蘆醇作為食品添加劑,能夠緩解高脂日糧造成的脂質(zhì)代謝損傷、糖酵解損傷及三羧酸循環(huán)損傷。本研究進一步豐富了白藜蘆醇調(diào)控機體代謝方面的積極作用,也為調(diào)控機體飲食肥胖提供了新的思路和實驗依據(jù)。