藍(lán)莓花色苷對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞 和腹腔巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

劉玉晨,李敬雙,于 洋

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001)

藍(lán)莓(Blueberry),又名越橘、藍(lán)漿果、紅豆果等,是杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠果樹。藍(lán)莓果實(shí)中含有大量類黃酮、花色苷、酚酸等生物活性物質(zhì),具有防止腦神經(jīng)老化[1]、抗炎[2]、抗氧化[2]、保護(hù)肝臟[3]、提高機(jī)體免疫力[4]、減肥[5]等多種功能。

藍(lán)莓中花色苷的含量很高,原果含量達(dá)到 3.86%(果皮4.61%,汁1.29%),是其最重要的生物活性成分[6]?，F(xiàn)代研究表明,藍(lán)莓花色苷具有抗氧化[7]、清除自由基[7]、降血糖[7]、降血脂[7]、防止動(dòng)脈粥樣硬化[8]、防治骨質(zhì)疏松[7]、預(yù)防眼疾[7]、減肥[7]等作用。花色苷能激活免疫系統(tǒng),使血清免疫球蛋白免受自由基的侵害,激活巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)人體免疫力[1]。藍(lán)莓花色苷可破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性,導(dǎo)致微生物釋放胞內(nèi)成分而死亡;可抑制 DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,導(dǎo)致細(xì)菌死亡;能破壞菌體結(jié)構(gòu)成分(如膜蛋白),改變菌體形態(tài),使孢壁破裂,細(xì)菌死亡,從而發(fā)揮抗炎作用[1]。有研究表明,藍(lán)莓花色苷是至今為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的抗氧化劑,也是最強(qiáng)效的自由基清除劑,其抗氧化強(qiáng)度為維生素E(VE)的50倍,維生素C(VC)的20倍[1]。藍(lán)莓果實(shí)中的花色苷因其鮮艷的顏色和天然無(wú)毒的性質(zhì),特別適宜用作食品添加劑,目前已廣泛應(yīng)用到果醬、果凍、雪糕、冰淇淋、糖果、腌制品等食品中。近年來(lái),作為藥品來(lái)防治疾病的研究已經(jīng)初具規(guī)模,對(duì)藍(lán)莓花色苷的生物學(xué)功能,如作用基因、相關(guān)酶類、大分子活性物質(zhì)、靶器官、受體、分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑、作用機(jī)制等方面應(yīng)進(jìn)行深入的研究。

為探討藍(lán)莓花色苷的免疫調(diào)節(jié)活性,本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)莓花色苷作用于體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞,通過檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性及相關(guān)因子的作用,考察其提高機(jī)體免疫力的功能,為藍(lán)莓花色苷的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

Balb/c小鼠 SPF級(jí),體重(20±2) g,6～8周齡,錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院,生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(遼)2014-0004;藍(lán)莓花色苷 晨光生物技術(shù)有限公司,純度≥85%;新生牛血清 浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品;甲基噻唑藍(lán)(MTT)、臺(tái)盼藍(lán)、RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 北京索萊寶科技有限公司;小鼠TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒 武漢博士德公司。

Varioskan FlashT多功能酶標(biāo)儀 Thermo Fisher Scientific;SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司,;CKX41SF倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司,;TD5A低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司,;96孔或24孔板臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭(TDL80-2B);CO2培養(yǎng)箱 日本SHELLAB。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淋巴細(xì)胞懸液制備 參考?？鹊萚9]、馬玉芳等[10]實(shí)驗(yàn)方法,小鼠用頸部斷髓法處死,75%酒精浸泡3 min消毒,在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)取脾,用PBS沖洗2次,置于RPMI-1640培養(yǎng)基中,用注射器拉桿柄將其磨碎,200目濾網(wǎng)過濾。收集濾液置于離心管中,1500 r/min 4 ℃離心5 min,棄上清,加入Tris-NH4Cl 3 mL裂解紅細(xì)胞,靜置5 min,加入D-Hanks液終止反應(yīng),D-Hanks液洗滌3次后,用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸沉淀細(xì)胞并過濾,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè),細(xì)胞活力達(dá)95%以上。加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL,制成淋巴細(xì)胞懸液。

1.2.2 巨噬細(xì)胞懸液制備 參考張思哲等[11]、戴藝等[12]實(shí)驗(yàn)方法,每只小鼠腹腔注射2 mL 5%淀粉肉湯,36 h頸椎脫臼法處死小鼠,75%酒精浸泡3 min消毒,在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)從腹白線處剪開皮膚,將皮膚剝離向兩側(cè),暴露出腹壁肌肉,腹腔注入4 mL RPMI-1640培養(yǎng)基,輕揉腹部3 min,靜置5 min后抽取腹腔洗液,置于離心管中,1500 r/min 4 ℃離心5 min,棄上清,PBS洗兩遍。貼壁3 h,去除非貼壁細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞活力,細(xì)胞活力達(dá)到95%以上。加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基,將細(xì)胞密度調(diào)整為5×106個(gè)/mL,制成巨噬細(xì)胞懸液。

1.2.4 藍(lán)莓花色苷對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響 用中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)法檢測(cè),參考楊平等[13]實(shí)驗(yàn)方法,實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、陽(yáng)性組、藍(lán)莓花色苷處理組。用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每組均設(shè)5復(fù)孔,每孔加入100 μL巨噬細(xì)胞懸液?？瞻捉M每孔加入100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,陽(yáng)性組每孔加入100 μL含有左旋咪唑(終濃度為5 μg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基;藍(lán)莓花色苷處理組每孔分別加入100 μL含不同濃度藍(lán)莓花色苷(終濃度為4、8、16、32和64 mg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。各細(xì)胞培養(yǎng)孔用PBS 洗滌后加入1 g/L的中性紅生理鹽水100 μL,繼續(xù)培養(yǎng) 30 min,吸棄上清并用PBS洗滌3次,各孔加入細(xì)胞裂解液100 μL,4 ℃過夜裂解細(xì)胞,酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm的OD值,以O(shè)D值判定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性。

1.2.5 藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 用ELISA法檢測(cè),參考Xie等[14]實(shí)驗(yàn)方法,實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、陽(yáng)性組、藍(lán)莓花色苷處理組。用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每組均設(shè)5復(fù)孔,每孔加入1 mL淋巴細(xì)胞懸液。空白組每孔加入 1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,陽(yáng)性組每孔加入1 mL含有左旋咪唑(終濃度為5 μg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基;藍(lán)莓花色苷處理組每孔加入1 mL含不同濃度藍(lán)莓花色苷(終濃度為4、8、16、32和64 mg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h后,1 500 r/min 4 ℃離心5 min,收集上清。用ELISA 法檢測(cè)藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞TNF-α、IL-6分泌的影響,參考小鼠細(xì)胞因子試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.6 藍(lán)莓花色苷對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 用ELISA法檢測(cè),參考Xie等[14]實(shí)驗(yàn)方法,實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、陽(yáng)性組、藍(lán)莓花色苷處理組。用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每組均設(shè)5復(fù)孔,每孔加入1 mL腹腔巨噬細(xì)胞懸液?？瞻捉M每孔加入 1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,陽(yáng)性組每孔加入1 mL含有左旋咪唑(終濃度為5 μg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基;藍(lán)莓花色苷處理組每孔加入1 mL含不同濃度藍(lán)莓花色苷(終濃度為4、8、16、32和64 mg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h后,1500 r/min 4 ℃離心5 min,收集上清。用ELISA法檢測(cè)藍(lán)莓花色苷對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞IL-4、IL-12分泌的影響,參考小鼠細(xì)胞因子試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

由圖1可知,MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示,藍(lán)莓花色苷各濃度組和陽(yáng)性組與空白對(duì)照組比較,淋巴細(xì)胞增殖率均顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05);藍(lán)莓花色苷在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),淋巴細(xì)胞增殖率隨藍(lán)莓花色苷濃度的升高而增大,呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,繼續(xù)升高藍(lán)莓花色苷濃度至64 mg/mL,淋巴細(xì)胞增殖率反而顯著下降(p<0.05);藍(lán)莓花色苷各濃度組與陽(yáng)性組相比,藍(lán)莓花色苷為32 mg/mL 濃度組淋巴細(xì)胞增殖率無(wú)顯著差異(p>0.05),藍(lán)莓花色苷其他濃度組淋巴細(xì)胞增殖率顯著下降(p<0.05)。

圖1 藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effects of blueberry anthocyanins on proliferation of lymphocytes注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖6同。

2.2 藍(lán)莓花色苷對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

由圖2可知,藍(lán)莓花色苷各濃度組與陽(yáng)性組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性值均顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05);藍(lán)莓花色苷在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性隨藍(lán)莓花色苷濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,繼續(xù)升高藍(lán)莓花色苷濃度至64 mg/mL,腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性反而下降;與陽(yáng)性組相比,藍(lán)莓花色苷為8、16、32、64 mg/mL 濃度組腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性無(wú)顯著性差異(p>0.05),藍(lán)莓花色苷為4 mg/mL 濃度組腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性顯著降低(p<0.05)。

圖2 藍(lán)莓花色苷對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Fig.2 The effects of blueberry anthocyanins on phagocytosis of macrophages

2.3 藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

2.3.1 藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞IL-6分泌的影響 由圖3可知,ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,藍(lán)莓花色苷各濃度組與陽(yáng)性組淋巴細(xì)胞IL-6分泌量均高于空白對(duì)照組(p<0.05);在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),淋巴細(xì)胞IL-6分泌量隨藍(lán)莓花色苷濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,繼續(xù)升高藍(lán)莓花色苷濃度至64 mg/mL,淋巴細(xì)胞IL-6分泌量反而下降;與陽(yáng)性組相比,藍(lán)莓花色苷為16、32 mg/mL濃度組淋巴細(xì)胞IL-6分泌量無(wú)顯著差異(p>0.05),藍(lán)莓花色苷為4、8、64 mg/mL濃度組淋巴細(xì)胞IL-6分泌量顯著降低(p<0.05)。

圖3 藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞IL-6分泌的影響Fig.3 The effects of blueberry anthocyanins on secretion of IL-6 in lymphocytes

2.3.2 藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞TNF-α分泌的影響 由圖4可知,ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示,藍(lán)莓花色苷各濃度組與陽(yáng)性組淋巴細(xì)胞TNF-α分泌量均高于空白對(duì)照組(p<0.05);在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),淋巴細(xì)胞TNF-α分泌量隨藍(lán)莓花色苷濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,繼續(xù)升高藍(lán)莓花色苷濃度至64 mg/mL,淋巴細(xì)胞TNF-α分泌量反而下降;與陽(yáng)性組相比,藍(lán)莓花色苷為32 mg/mL濃度組淋巴細(xì)胞TNF-α分泌量顯著升高(p<0.05),藍(lán)莓花色苷為16、64 mg/mL濃度組淋巴細(xì)胞TNF-α分泌量無(wú)顯著差異(p>0.05),藍(lán)莓花色苷為4、8 mg/mL濃度組淋巴細(xì)胞TNF-α分泌量顯著降低(p<0.05)。

2.4 藍(lán)莓花色苷對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

2.4.1 藍(lán)莓花色苷對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞IL-4分泌的影響 由圖5可知,ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示,藍(lán)莓花色苷各濃度組與陽(yáng)性組腹腔巨噬細(xì)胞IL-4分泌量均低于空白對(duì)照組(p<0.05);在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),腹腔巨噬細(xì)胞IL-4分泌量隨藍(lán)莓花色苷濃度的升高而降低,繼續(xù)升高藍(lán)莓花色苷濃度至64 mg/mL,腹腔巨噬細(xì)胞IL-4分泌量反而顯著(p<0.05)升高;與陽(yáng)性組相比,藍(lán)莓花色苷為32 mg/mL 濃度組腹腔巨噬細(xì)胞IL-4分泌量無(wú)顯著差異(p>0.05),其余各濃度組腹腔巨噬細(xì)胞IL-4分泌量均顯著升高(p<0.05)。

圖5 藍(lán)莓花色苷對(duì)巨噬細(xì)胞IL-4分泌的影響Fig.5 The effects of blueberry anthocyanins on secretion of IL-4 in macrophages

2.4.2 藍(lán)莓花色苷對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞IL-12分泌的影響 由圖6可知,ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,藍(lán)莓花色苷各濃度組與陽(yáng)性組腹腔巨噬細(xì)胞IL-12分泌量均高于空白對(duì)照組(p<0.05);在4～32 mg/mL濃度范圍內(nèi),腹腔巨噬細(xì)胞IL-12分泌量隨藍(lán)莓花色苷濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,繼續(xù)升高藍(lán)莓花色苷濃度至64 mg/mL,腹腔巨噬細(xì)胞IL-12分泌量反而下降;與陽(yáng)性組相比,藍(lán)莓花色苷為16、32 mg/mL 濃度組腹腔巨噬細(xì)胞IL-12分泌量無(wú)顯著差異(p>0.05),其余各濃度組腹腔巨噬細(xì)胞IL-12分泌量顯著降低(p<0.05)。

圖6 藍(lán)莓花色苷對(duì)巨噬細(xì)胞IL-12分泌的影響Fig.6 The effects of blueberry anthocyanins on secretion of IL-12 in macrophages

3 討論

3.1 藍(lán)莓花色苷對(duì)淋巴細(xì)胞及其相關(guān)因子的作用

脾臟占全身淋巴組織總量的25%,正常情況下,脾臟作為體內(nèi)最大的外周免疫器官,淋巴細(xì)胞受抗原激活即分化增殖,吞噬消除衰老紅細(xì)胞、細(xì)菌及異物,產(chǎn)生大量抗體,參與機(jī)體免疫反應(yīng)[15]。淋巴細(xì)胞由淋巴器官產(chǎn)生,是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分[16]。杜聯(lián)峰等[17]利用西紅花苷研究其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,發(fā)現(xiàn)西紅花苷具有刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用。高笑笑等[18]采用MTT 法檢測(cè)雪靈芝粗多糖對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示,雪靈芝粗多糖處理組對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖具有體外激活作用?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫結(jié)晶物formazan,并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能[19],因此,本實(shí)驗(yàn)以左旋咪唑?yàn)殛?yáng)性對(duì)照,采用MTT法觀察藍(lán)莓花色苷對(duì)體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞增殖功能的影響,結(jié)果顯示,藍(lán)莓花色苷與左旋咪唑?qū)π∈笃⒘馨图?xì)胞增殖均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。

細(xì)胞因子是參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的重要介質(zhì),TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì),能調(diào)節(jié)其它組織代謝活性并促使其它細(xì)胞因子的合成和釋放。IL-6由巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種多效應(yīng)細(xì)胞因子,能夠刺激B細(xì)胞增殖,分泌抗體,刺激T細(xì)胞增殖及CTL活化,增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)及T細(xì)胞的抗腫瘤活性,在細(xì)胞免疫應(yīng)答和造血調(diào)節(jié)中以自分泌或旁分泌方式發(fā)揮重要作用[20]。Xie等[21]利用藍(lán)莓花色苷對(duì)巨噬細(xì)胞抗炎作用的研究中,發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷能降低小鼠血清中TNF-α和IL-6含量,降低腹腔巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá);抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá),其機(jī)制可能是藍(lán)莓花色苷通過抑制RAW 264.7 細(xì)胞的NF-κB、MAPK p38和JNK信號(hào)通路活化有關(guān)。劉英姿等[22]利用碎米花杜鵑葉中分離得到的化合物原花青素A-1研究其免疫增強(qiáng)的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,原花青素A-1各濃度在體外能增加Con A刺激的脾細(xì)胞分泌的輔助性T細(xì)胞亞群(Th1)細(xì)胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α)的分泌量和Con A刺激的脾細(xì)胞分泌的抑制Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)的分泌量。王志宏等[23]采用MTT法和ELISA技術(shù),通過考察不同純度的杜仲黃酮對(duì)淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ誘生作用的影響。結(jié)果顯示,杜仲黃酮粗品及槲皮素均對(duì)經(jīng)Con A或LPS刺激下的淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子IL-2與IFN-γ的分泌有協(xié)同作用。在本實(shí)驗(yàn)中,藍(lán)莓花色苷可使淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-6、TNF-α水平呈濃度依賴性升高,并提示藍(lán)莓花色苷可通過刺激淋巴細(xì)胞IL-6、TNF-α分泌來(lái)提高淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。同時(shí)藍(lán)莓花色苷不僅可直接性激活腹腔巨噬細(xì)胞,并可通過上調(diào) IL-6、TNF-α水平間接性地增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷功能。本實(shí)驗(yàn)所利用的藍(lán)莓花色苷與原花青素、杜仲黃酮同屬黃酮類物質(zhì),且同劉英姿、王志宏等利用原花青素、杜仲黃酮對(duì)小鼠免疫功能影響的研究結(jié)果是一致的。

3.2 藍(lán)莓花色苷對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力及其相關(guān)因子的作用

吞噬作用在巨噬細(xì)胞中是一個(gè)受到高度調(diào)節(jié)的功能,靜止、循環(huán)的巨噬細(xì)胞僅有最低限度的吞噬能力,接觸其他信號(hào),如抗原和細(xì)胞因子等可激活巨噬細(xì)胞,并使巨噬細(xì)胞功能增強(qiáng)[24]。Mantovani等[25]認(rèn)為巨噬細(xì)胞不但能夠通過分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子,介入免疫應(yīng)答,發(fā)揮免疫監(jiān)視功能,還可通過抑制細(xì)胞因子IL-10/TGF-B等下調(diào)免疫應(yīng)答,在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。李佳等[26]等利用原花青素與熟地對(duì)小鼠免疫功能的影響,發(fā)現(xiàn)原花青素與熟地能夠提高免疫器官的增長(zhǎng)指數(shù)、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能以及DNFB所致遲發(fā)型超敏反應(yīng)的能力,兩種藥物配合使用能顯著調(diào)節(jié)小鼠免疫功能。本實(shí)驗(yàn)以左旋咪唑?yàn)殛?yáng)性對(duì)照,采用中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力,結(jié)果顯示,藍(lán)莓花色苷與左旋咪唑?qū)Ω骨痪奘杉?xì)胞中性紅吞噬活性顯著或極顯著提高,并提示藍(lán)莓花色苷對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠固有性免疫細(xì)胞功能均具有明顯的促進(jìn)作用?；ㄉ帐腔ㄇ嗨嘏c糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物,植物中花青素多以花色苷的形式存在。本實(shí)驗(yàn)與李佳等[26]利用原花青素與熟地對(duì)小鼠免疫功能影響的研究結(jié)果是一致的。

IL-4對(duì)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用,具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞提呈抗原和殺傷腫瘤細(xì)胞的功能,可能與調(diào)節(jié)MHC Ⅱ類抗原和FcR表達(dá)有關(guān)。IL-4是小鼠巨噬細(xì)胞趨化因子,并促進(jìn)IL-1ra產(chǎn)生,但抑制單核細(xì)胞IL-1、TNF和IL-6的產(chǎn)生。IL-12主要由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,IL-12通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ激活巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)其TNF-α的分泌。IL-12可誘導(dǎo)Th1亞群的形成,此作用可能通過兩種途徑,一是IL-12直接作用于Th1亞群;二是IL-12刺激T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ誘導(dǎo)Th1亞群形成。王曉利等[27]為探討甘草的3種主要成分甘草甜素、甘草多糖和光甘草定對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性與免疫功能的調(diào)節(jié)作用,將3種藥物分別與巨噬細(xì)胞作用12、24和36 h后,用ELISA試劑盒檢測(cè)3種藥物對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。結(jié)果顯示,所有實(shí)驗(yàn)濃度的3種藥物均能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的能力(p<0.01),高劑量抑制IL-4、IL-10和TGF-β的分泌(p<0.01),而低劑量沒有明顯變化。在本實(shí)驗(yàn)中,藍(lán)莓花色苷可使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12水平呈濃度依賴性升高,并提示藍(lán)莓花色苷可通過刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12分泌來(lái)提高巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。4、8、16、32 mg/mL的藍(lán)莓花色苷抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-4,濃度為64 mg/mL開始促進(jìn)IL-4分泌。提示藍(lán)莓花色苷呈劑量依賴性地分泌促炎性細(xì)胞因子以及降低抑炎性細(xì)胞因子的分泌,來(lái)發(fā)揮腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)所利用的藍(lán)莓花色苷與光甘草定同屬黃酮類物質(zhì),且同王曉利等[27]利用甘草的3種主要成分甘草甜素、甘草多糖和光甘草定對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果是一致的。

4 結(jié)論

藍(lán)莓花色苷可通過促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的分泌,來(lái)提高淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性;通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能和細(xì)胞因子IL-12的分泌以及降低IL-4的分泌,來(lái)提高巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性,從而提高機(jī)體免疫功能。