南美白對蝦貯藏過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化

葛敏敏,王建華,劉靖靖,王 穎,李 曉,湯志旭

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266001; 2.青島海關檢驗檢疫技術中心,山東青島 266002; 3.山東省海洋生物研究院,山東青島 266000)

南美白對蝦(Penaeusvannamei),又稱凡納濱對蝦,不僅蛋白質(zhì)含量高，而且含有豐富的多不飽和脂肪酸及鎂、鈣、磷、碘等微量元素,營養(yǎng)價值非常高。但因其水分、蛋白質(zhì)含量高,組織蛋白酶活性較強等特點,南美白對蝦不易貯藏,易于腐敗變質(zhì)產(chǎn)生異味,影響其品質(zhì)。

固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)是20世紀90年代初由加拿大Watrloo大學Pawliszyn所在科研小組研發(fā)的無溶劑的樣品前處理技術[1],集萃取、濃縮、解析為一體,是目前應用最廣泛的海產(chǎn)品揮發(fā)性成分的提取方法。Mall[2]、藺佳良[3]利用SPME技術，分別研究了不同加工方式下的的南美白對蝦的揮發(fā)性風味物質(zhì),贠三月[4]研究了南美白對蝦不同部位的揮發(fā)性風味物質(zhì),而朱亞珠[5]、郭美娟[6]利用SPME技術，分別研究了室溫貯藏下毛蝦蝦皮、25 ℃貯藏條件下南美白對蝦揮發(fā)性物質(zhì)的變化。目前對蝦的揮發(fā)性物質(zhì)研究主要集中在風味物質(zhì)的研究上,而對其貯藏過程中揮發(fā)性物質(zhì)變化研究較少。對于揮發(fā)性物質(zhì)定性,目前通常都要求GC-MS分析未知揮發(fā)性化合物時計算保留指數(shù)(retention index,RI),認為GC-MS結合RI及標準品的匹配法進行定量分析是可信度最高的方法[7]。

對于特征揮發(fā)性物質(zhì)的篩選,Kuuliala[8]采用聚類分析、主成分分析、偏最小二乘回歸分析(PLS)對不同氣調(diào)包裝(4 ℃ 貯藏)條件下褐蝦和大西洋鱈魚揮發(fā)性物質(zhì)分析,找出多種腐敗的潛在標記物質(zhì);主成分分析法是一種將多個指標化為少數(shù)互相無關的綜合指標的統(tǒng)計學方法,在揮發(fā)性物質(zhì)分析中得到廣泛應用[9-10],朱丹實[11]利用揮發(fā)性物質(zhì)與(total volatile base nitrogen,TVB-N)相關性分析得出多種新鮮度指示物。

本實驗采用HS-SPME-GC-MS并結合RI定性的方法,分析4 ℃ 貯藏南美白對蝦0～12 d揮發(fā)性物質(zhì)變化情況,并且利用主成分分析和相關性分析方法進行揮發(fā)性物質(zhì)的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦 山東東營養(yǎng)殖;正己烷(色譜純)上海植茂環(huán)?？萍加邢薰?正庚烷(色譜純)上海麥克林生化科技有限公司;C8～C36正構烷烴(色譜純) 美國色譜科公司;三甲胺鹽酸鹽(98%) 上海麥克林生化科技有限公司。

帶有Agilent PAL3自動進樣系統(tǒng)的7890A-240氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;2300全自動凱氏定氮儀 瑞典福斯集團公司;50/30 μm二乙烯苯(DVB)/碳分子篩(CAR)/聚二甲基硅烷(PDMS)萃取頭 美國色譜科公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南美白對蝦的貯藏和揮發(fā)性物質(zhì)的萃取 南美白對蝦蝦解凍,瀝干水分,放置于4 ℃冰箱中貯藏,每天測其揮發(fā)性物質(zhì)(0～12 d)。將蝦去除頭部、尾部、蝦殼,打碎稱取2.00 g于頂空進樣瓶中,50 ℃條件下,平衡5 min,萃取50 min;進樣口解析5 min(250 ℃),用GC-MS進行分離鑒定。

1.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)的分離與檢測 采用GC-MS對揮發(fā)性物質(zhì)進行分離和檢測。色譜條件:色譜柱為HP-5 毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);程序升溫模式,初始40 ℃保持5 min,以5 ℃/min升至220 ℃,保持5 min;進樣口溫度250 ℃;He為載氣,流速是0.8 mL/min,不分流模式進樣。質(zhì)譜條件:電離方式為EI,電離能量為70 eV;接口溫度為280 ℃;離子阱溫度為200 ℃;質(zhì)量掃描范圍為35～300 m/z。

1.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量 揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)NIST14譜庫檢索與保留指數(shù)定性,其中匹配率>800(完全匹配為1000),所有文獻中的保留指數(shù)信息均在NIST14查得;以峰面積進行定量分析。

保留指數(shù)計算公式:IT=100Z+100[TR(x)-TR(z)]/[TR(z+1)-TR(z)]

1.3 circRNA的類別 理論上，circRNA可以產(chǎn)生于基因組的任何區(qū)域。一個circRNA通常由1～5個外顯子和/或1～2個內(nèi)含子組成，可能同時含有編碼區(qū)或非編碼區(qū)成分。根據(jù)組成不同可以將circRNA分為內(nèi)含子環(huán)狀RNA (intronic circRNA)、外顯子環(huán)狀RNA (exon circRNA)、外顯子—內(nèi)含子環(huán)狀RNA (exon-intron circRNA)和基因間區(qū)環(huán)狀RNA (intergenic circRNA)4個類別[5]。

式中,TR(z)、TR(z+1)代表正構烷烴的保留時間,TR(x)代表揮發(fā)性物質(zhì)的保留時間,Z代表正構烷烴碳的個數(shù),其中TR(z+1)>TR(x)>TR(z)。

1.2.4 TVB-N的測定 采用全自動凱氏定氮儀按照GB/T 5009.228-2016食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定[12]測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

聚類分析法:采用系統(tǒng)聚類的方法,以歐氏距離的平方為度量標準,通過組間連接的方式以66 種揮發(fā)性物質(zhì)作為變量,對樣品0～12 d 6個貯藏階段的揮發(fā)性物質(zhì)進行聚類分析。

主成分分析法:將數(shù)據(jù)標準化處理后,做因子分析,得到主成分的得分系數(shù)矩陣、方差貢獻率、特征值及旋轉成分矩陣,求不同揮發(fā)性物質(zhì)的主成分綜合評價得分(由主成分方差貢獻率對主成分得分加權求平均值得到,記為F),并根據(jù)旋轉成分矩陣做主成分分析載荷圖。

利用Excel 2010、SPSS 19、Origin 9軟件對南美白對蝦貯藏過程中肌肉揮發(fā)性成分進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 南美白對蝦4 ℃貯藏過程中的揮發(fā)性物質(zhì)

南美白對蝦4 ℃貯藏0～12 d的揮發(fā)性物質(zhì)定性及定量變化見表1,共檢出66種,其中包括醛類12種、醇類11種、酮類9種、酯類10種、酸類2種、烴類7種、含氮物質(zhì)6種、含硫物質(zhì)7種、其他2種。

表1 南美白對蝦貯藏過程中肌肉的揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Volatile components of Penaeus vannamei muscle during storage

續(xù)表

2.1.1 醛類、醇類、酮類物質(zhì) 南美白對蝦揮發(fā)性物質(zhì)中的醛類、醇類、酮類物質(zhì)的種類占揮發(fā)性物質(zhì)的一半,這三類揮發(fā)性物質(zhì)中的脂肪族類物質(zhì),主要來源于脂肪氧化。南美白對蝦中多不飽和脂肪酸酶促氧化,生成的醛、酮、醇等化合物主要為C6、C8、C9化合物,其中,C6化合物呈青草味,C8化合物呈蘑菇或紫羅蘭的氣味,C9化合物呈類似黃瓜的香味,這些化合物是新鮮南美白對蝦清香味的主要來源[13],南美白對蝦中此類物質(zhì)有2-乙基己醇、2-壬酮等物質(zhì);脂肪的非酶促氧化,產(chǎn)生的醛酮化合物,以適當濃度存在時可以賦予南美白對蝦特殊的風味,但其含量過高就會使南美白對蝦產(chǎn)生哈喇味,此類的揮發(fā)性物質(zhì)有10-十一烯醛、癸醛、肉豆蔻醛、十五醛、十六醛、十八醛。非脂肪族物質(zhì)苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇可能來源于苯丙氨酸的Strecker降解的產(chǎn)物[14],其中苯乙醇為儲藏后期(8～12 d)的特征揮發(fā)性物質(zhì)。各種C6～C10醛類、醇類、酮類化合物可能是非微生物來源,而如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛等分子量較小的則與微生物代謝有關[15],其含量的增加是南美白對蝦貯藏過程中微生物代謝累積的結果。

2.1.2 酯類、烴類、含氮類、含硫類及其他類物質(zhì) 酯類物質(zhì)來源于脂肪酸和醇類物質(zhì)的酯化反應,一般具有果香味,對腥味有一定的削減作用。酸類物質(zhì)僅檢出2種且含量不高,對整個貯藏過程中南美白對蝦新鮮度變化影響不大。烴類主要是烷基自由基的脂質(zhì)自氧化過程或類胡蘿卜素分解產(chǎn)生,一般閾值較高,通常認為對產(chǎn)品整體風味貢獻不大[16],因此烴類物質(zhì)含量的變化對南美白對蝦風味的變化影響不大。含氮物質(zhì)中亞胺脲、三甲胺、吡嗪、吲哚變化程度較大,其含量大致呈上升趨勢,其中亞胺脲可能來源于生物胺(胍基丁胺)的分解;三甲胺是由南美白對蝦中的氧化三甲胺經(jīng)兼性厭氧菌還原而產(chǎn)生的揮發(fā)性含氮物質(zhì),其含量的增加會使南美白對蝦腥味加重;吡嗪類化合物賦予產(chǎn)品焦糊味和烤面包味,為美拉德反應產(chǎn)物[17],是南美白對蝦貯藏后期的特征揮發(fā)性物質(zhì);吲哚具有腐敗臭氣,是由微生物降解蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生[18],其含量增加會使南美白對蝦產(chǎn)生明顯的臭味。含硫物質(zhì)一般來源于含硫氨基酸的降解,一般具有刺激性氣味,如二甲基三硫化物是魚露特征香味。其他揮發(fā)性物質(zhì)包括苯并噻唑,主要是還原糖在硫化氫和氨存在下,通過熱降解得到的[17]。

揮發(fā)性物質(zhì)還可能來源于環(huán)境污染物。有文獻認為，海產(chǎn)品中的萘、苯類化合物是從飼料和環(huán)境中轉移積蓄到魚體中,在草魚[19]、鱖魚[20]等多種水產(chǎn)品中均有檢出;二硫化碳、三溴甲烷水體污染物分別在中華鱉[21]、縊蟶稚貝[22]中有檢出。

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)變化與新鮮度的相關性分析

2.2.1 揮發(fā)性物質(zhì)的聚類分析 聚類分析結果見圖1,當橫坐標距離為9.5時,南美白對蝦樣品可分為貯藏0～4、5～8、9～10、11、12 d 5個集群,由此可見，通過對揮發(fā)性物質(zhì)變化的聚類分析可區(qū)分不同新鮮度的南美對蝦樣品。

圖1 不同貯藏時期南美白對蝦肌肉樣品的聚類分析圖Fig.1 Dendrogram of Penaeus vannamei muscle samples at different storage periods

2.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)聚類與TVB-N的相關性 由圖2可知,南美白對蝦貯藏6 d后(包含第6 d)TVB-N含量超過國標30 mg/100 g,并且TVB-N(y)隨時間(x)的變化與冪函數(shù)y=9.41e0.21x擬合,擬合度R2=096,說明TVB-N的變化率越來越大。

圖2 貯藏南美白對蝦的TVB-N變化Fig.2 Changes of TVB-N of Penaeus vannamei during storage

以TVB-N作為衡量南美白對蝦的新鮮度的理化指標,南美白對蝦聚類分析的第1個集群為貯藏0～4 d,代表沒有腐敗變質(zhì)的南美白對蝦;第2個集群為貯藏5～8 d南美白對蝦,代表腐敗的南美白對蝦(除第5 d外都已腐敗變質(zhì));第3、4、5個集群分別為貯藏9～10、11、12 d的南美白對蝦,他們都代表嚴重腐敗變質(zhì)的南美白對蝦。第3、4、5個集群樣品特征值差異較大,說明這三個集群間揮發(fā)性物質(zhì)差異較大,9～12 d揮發(fā)性物質(zhì)的差異越來越大,這與TVB-N變化速率越來越大相一致,說明南美白對蝦貯藏9～12 d相較于貯藏前期新鮮度變化速率加快。

總之,南美白對蝦揮發(fā)性物質(zhì)的變化不僅可以將不同新鮮度南美白對蝦進行歸類,而且可以表征南美白對蝦新鮮度的變化速率。

2.3 特征揮發(fā)性物質(zhì)篩選

2.3.1 根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)與新鮮度(即TVB-N)的相關性進行特征揮發(fā)性物質(zhì)篩選 仍以TVB-N作為衡量南美白對蝦的新鮮度的變化的理化指標,將南美白對蝦揮發(fā)性物質(zhì)與TVB-N變化進行相關性分析,極顯著相關(p<0.01)的揮發(fā)性物質(zhì)有29種,見表1。這29種特征揮發(fā)性物質(zhì)中包括16種貯藏過程中(除第0 d外)共有的揮發(fā)性物質(zhì)和13種貯藏過程中出現(xiàn)的揮發(fā)性物質(zhì)。其中共有的揮發(fā)性物質(zhì)可作為南美白對蝦新鮮度相關物質(zhì),其含量變化可以用來表征新鮮度的變化;貯藏過程中出現(xiàn)的揮發(fā)性物質(zhì)可根據(jù)其在貯藏過程中出現(xiàn)的時間作為南美白對蝦新鮮度節(jié)點物質(zhì),新鮮度相關物質(zhì)和新鮮度節(jié)點物質(zhì)種類如表2所示。

表2 南美白對蝦肌肉特征揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 Characteristic volatile components of Penaeus vannamei muscle

2.3.2 以主成分分析進行特征揮發(fā)性物質(zhì)篩選 主成分個數(shù)的選取要遵循既減少變量的個數(shù)又有利于對實際問題的分析和研究的原則,先按累積方差貢獻率不低于某個閥值(比如85%)的原則確定前幾個主成分,然后以每個主成分各自的貢獻率為權數(shù)，將選定主成分線性加權求和來綜合評價樣本的優(yōu)劣[23-24]。對4 ℃ 貯藏南美白對蝦69種揮發(fā)性物質(zhì)進行主成分分析,提取特征值>1的3個主成分(記為F1、F2、F3),如表3所示,3個主成分的總方差貢獻率累積達到 89.72%,故選取F1、F2、F3這3個主成分。

表3 主成分方差貢獻率Table 3 Variance contribution of principal components

由圖3可以看出，南美白對蝦貯藏0～7 d樣品在第2、3主成分上載荷較大,貯藏8～12 d樣品在第1主成分上載荷較大,說明貯藏第0～7 d樣品與第2、3主成分高度正相關,貯藏8～12 d樣品與第1主成分高度正相關。

圖3 不同貯藏時間的南美白對蝦肌肉 揮發(fā)性成分主成分分析載荷圖Fig.3 PCA load diagram of volatile components in Penaeus vannamei’s muscle at different storage periods

各揮發(fā)性成分得分如表4所示(只分析主成分得分大于1的揮發(fā)性物質(zhì)),吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇與第1主成分相關性最大,亞氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯與第2主成分相關性最大,壬醛、辛醇、二烯丙基二硫與第3主成分相關性最大。由此可以說明，第1主成分代表的揮發(fā)性物質(zhì)有吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇,第2主成分代表的揮發(fā)性物質(zhì)有亞氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯,第3主成分代表的揮發(fā)性物質(zhì)有壬醛、辛醇、二烯丙基二硫。

表4 各揮發(fā)性物質(zhì)主成分得分及排序Table 4 Evaluation results and rank of principal components for volatile components

續(xù)表

因此,南美白對蝦貯藏0～7 d樣品的特征揮發(fā)性物質(zhì)為亞氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯、壬醛、辛醇、二烯丙基二硫;貯藏8～12 d樣品的特征揮發(fā)性物質(zhì)為吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇。

主成分綜合評價得分如表4所示,吡嗪、2-乙基己醇、亞氨脲對南美白對蝦貯藏過程整體揮發(fā)性物質(zhì)貢獻較大,可作為南美白對蝦4 ℃貯藏0～12 d整個過程的特征揮發(fā)性物質(zhì)。

3 結論

本研究中共檢出66種揮發(fā)性物質(zhì),而且大部分揮發(fā)性物質(zhì)都經(jīng)過過保留指數(shù)(RI)定性,并對其來源及變化規(guī)律進行分析。南美白對蝦4 ℃貯藏條件下其揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量隨之發(fā)生變化,通過對樣品揮發(fā)性物質(zhì)變化的聚類分析可將不同貯藏時間的樣品聚類,且聚類情況也與南美白對蝦新鮮度變化一致,說明揮發(fā)性物質(zhì)可以用來表征南美白對蝦新鮮度的變化;利用相關性分析和主成分分析兩種方法進行特征揮發(fā)性物質(zhì)的篩選,分別確定南美白對蝦新鮮度相關物質(zhì)、新鮮度節(jié)點物質(zhì)和南美白對蝦貯藏各個時間階段及整個階段的特征揮發(fā)性物質(zhì),為揮發(fā)性物質(zhì)應用于南美白對蝦新鮮度的檢測提供理論基礎。