脂肪酶預(yù)處理及雞油添加 對(duì)蠶蛹呈味基料風(fēng)味的影響

陳 政,穆利霞,廖森泰,*,鄒宇曉

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070; 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東廣州 510610)

蠶蛹是蠶蛾科家蠶蛾的蛹,也是蠶繭繅絲后的主要副產(chǎn)物。長(zhǎng)期以來(lái),我國(guó)人民一直把它當(dāng)作滋補(bǔ)強(qiáng)生,健脾和胃,增長(zhǎng)肌肉,祛風(fēng)除濕的藥食佳品[1]。蠶蛹富含蛋白質(zhì),其干物質(zhì)粗蛋白含量在52%以上,蛋白質(zhì)中含有18種氨基酸,所含氨基酸配比均衡性好(必需氨基酸∶非必需氨基酸=0.7∶1),且必需氨基酸接近或超過(guò)總氨基酸的40%[2],符合FAO/WHO所建議的理想氨基酸模式(必需氨基酸占總氨基酸含量的40%,且必需氨基酸∶非必需氨基酸=0.6∶1),是一種優(yōu)質(zhì)的昆蟲(chóng)類(lèi)蛋白資源,也是受到衛(wèi)生部認(rèn)可并批準(zhǔn)的“作為普通食品管理的食品新資源名單”中唯一的昆蟲(chóng)類(lèi)食品[3]。

目前,市場(chǎng)上的蠶蛹類(lèi)相關(guān)產(chǎn)品主要包括即食蠶蛹、蠶蛹油、蠶蛹蛋白粉、蠶蛹醬油、氨基酸口服液等,但這些產(chǎn)品往往技術(shù)含量不高,無(wú)顯著的保健功能或者缺少產(chǎn)品的更新?lián)Q代,因此并沒(méi)能在市場(chǎng)上占得一席之地,從而造成蠶蛹蛋白資源不能得到廣泛利用[4]?？蒲腥藛T對(duì)蠶蛹等昆蟲(chóng)類(lèi)蛋白的研究主要集中在對(duì)其營(yíng)養(yǎng)功能的分析和討論,或基于蛋白質(zhì)的物理或者化學(xué)改性、活性肽的提取、水解氨基酸的制備,及蠶蛹蛋白粉的蠶蛹多肽的制備[5]。鄭仕遠(yuǎn)[6]利用蛋白改性的原理,研究蠶蛹蛋白的酶解工藝,發(fā)現(xiàn)經(jīng)前處理(脫脂、脫纖維)和改性后的蠶蛹蛋白的酶解效率得到了改善。肖燕平等[7]發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物具有很強(qiáng)的體外抗氧化活性。昌友權(quán)等[8]指出蠶蛹蛋白對(duì)體細(xì)胞有顯著的免疫作用。宋蓮軍等[9]將脫脂后的蠶蛹進(jìn)行水解,得到的酶解產(chǎn)物水解度達(dá)23.75%,水解液中18種氨基酸的濃度達(dá)15.64 g/L。魯珍等[10]研究發(fā)現(xiàn),蠶蛹來(lái)源豐富,蛋白質(zhì)和鮮甜味氨基酸含量高,是制備呈味基料的優(yōu)質(zhì)原料,利用蠶蛹制備呈味基料可以大大提高蠶蛹的利用價(jià)值。蠶蛹雖然蛋白含量高,但蠶蛹因其蛋白生產(chǎn)技術(shù)的不足、腥臭味殘留及市場(chǎng)推廣等問(wèn)題,限制了它在食品、工業(yè)、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用。

針對(duì)蠶蛹制作的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物存在風(fēng)味單一,香氣不夠濃郁,苦味和腥臭味較重等問(wèn)題,本研究分別以新鮮削繭桑蠶蛹和柞蠶蛹為原料,通過(guò)脂肪酶的預(yù)處理和雞油的添加對(duì)桑蠶蛹和柞蠶蛹進(jìn)行處理,通過(guò)酶解和美拉德反應(yīng)制備呈味基料,以酶解產(chǎn)物的水解度、呈味基料的氨基酸組成、感官風(fēng)味等為評(píng)價(jià)指標(biāo),旨在探討不同處理對(duì)蠶蛹制備呈味基料風(fēng)味的綜合影響,為蠶蛹的呈味基料的制備和高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮剝繭桑蠶蛹 產(chǎn)地廣西,呈土黃色,身長(zhǎng)2～4 cm,單個(gè)重量2～4 g,鮮重蛋白含量12.83%;新鮮剝繭柞蠶蛹 產(chǎn)地黑龍江,呈黑褐色,身長(zhǎng)4～6 cm,單個(gè)重量12～16 g,鮮重蛋白含量16.36%;雞油 購(gòu)于廣州黃沙海鮮市場(chǎng);Novozym 37071(20.35×104U/g)、風(fēng)味蛋白酶(1.88×104U/g) 諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司;脂肪酶(3.00×104U/g) 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;L-半胱氨酸鹽酸鹽、硫胺素、D-木糖 上海伯奧生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

K8400凱氏定氮儀 瑞典FOSS 公司;PB-10 pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Biofuge Stratos Sorvall離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;L-8900 氨基酸分析儀 日本HITACHI公司;6890 N/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;75 μm(Carboxen/PDMS)萃取頭 美國(guó)Agilent公司;Supelco手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣手柄 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蠶蛹處理方式 漂燙滅酶:將桑蠶蛹和柞蠶蛹分別用沸水浴漂燙2 min;用榨汁機(jī)將滅酶后的蠶蛹打成漿,測(cè)定其蛋白含量:參照GB5009.5-2016。

1.2.2 脂肪酶的預(yù)處理 測(cè)得桑蠶蛹蛋白含量后,分別用蒸餾水將柞蠶蛹底物蛋白濃度調(diào)至10%(m/v),參照吳婕[11]的方法并加以改進(jìn),于50 ℃水浴中攪拌40 min,用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至8.0,一杯加入占溶液質(zhì)量2.7%的脂肪酶,另一杯不加脂肪酶作為空白對(duì)照,控制溫度為45 ℃,水解2 h。

測(cè)得柞蠶蛹蛋白含量后,用蒸餾水將柞蠶蛹底物蛋白濃度調(diào)至10%(m/v),于50 ℃水浴中攪拌40 min,用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至8.0,一杯加入占溶液質(zhì)量2.7%的脂肪酶,另一杯不加脂肪酶作為空白對(duì)照,控制溫度為45 ℃,水解2 h。

1.2.3 蠶蛹蛋白酶解液的制備 待上述4組樣品經(jīng)脂肪酶水解2 h后,用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至8.0,加入占樣品蛋白質(zhì)量5.4%的風(fēng)味蛋白酶、2.3%的Novozym 37071,控制溫度為50 ℃,開(kāi)始酶解,6 h后于沸水浴中滅酶10 min,過(guò)濾得蠶蛹酶解液。

1.2.4 水解度的測(cè)定 水解度(DH)測(cè)定:pH-stat法[12]。

1.2.5 雞油的添加及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備 將上述4組樣品各均分2份,一份添加2%的雞油,另一份不添加作為空白對(duì)照,得到八組樣品:蠶蛹不加脂肪酶不加雞油(SC),桑蠶酶不加脂肪酶加雞油(COSC),桑蠶蛹脂肪酶預(yù)處理不加雞油(LSC),桑蠶蛹脂肪酶預(yù)處理加雞油(LCOSC),柞蠶蛹不加脂肪酶不加雞油(OSC),柞蠶蛹不加脂肪酶加雞油(COOSC),柞蠶蛹脂肪酶預(yù)處理不加雞油(LOSC),柞蠶蛹脂肪酶預(yù)處理加雞油(LCOOSC)。參照魯珍等[10]的方法并稍作調(diào)整進(jìn)行美拉德反應(yīng):酶解液30 mL,D-木糖0.75 g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.6 g,硫胺素0.45 g,溫度110 ℃,時(shí)間60 min。

1.2.6 氨基酸的測(cè)定 分別檢測(cè)八組樣品的總氨基酸組成及含量,方法參照GB 5009.124-2016。

1.2.7 感官評(píng)價(jià) 參照吳婕等[11]的方法,對(duì)樣品從色澤、組織形態(tài)、氣味和滋味四個(gè)方面綜合評(píng)定并打分。本次實(shí)驗(yàn)采用100分制,每項(xiàng)指標(biāo)25分,每個(gè)樣品評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)去掉最高和最低評(píng)分后取平均值。感官評(píng)定小組由10位品評(píng)員組成。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 蠶蛹呈味肽感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criterion of silkworm chrysalis

1.2.8 風(fēng)味物質(zhì)成分的提取 采用頂空固相微萃取(HS-SPME)的方法,其中萃取頭在使用前要老化,以確保脫去其可能吸附的揮發(fā)性成分。老化后的萃取頭在GC-MS上檢測(cè)略有極少量的萃取頭固有雜質(zhì)峰出現(xiàn),在樣品質(zhì)譜庫(kù)檢索的時(shí)候去除,不計(jì)入最終結(jié)果。

固相微萃取的操作步驟:分別量取4 mL樣品于頂空萃取瓶中,應(yīng)用75 μm(Carboxen/PDMS)固相微萃取頭(Supelco,Bellefone,PA,USA)在50 ℃條件下萃取30 min富集揮發(fā)性化合物,然后用氣相色譜來(lái)分析纖維頭上的揮發(fā)性化合物[13]。

1.2.9 風(fēng)味物質(zhì)鑒定 色譜條件(GC):J&W 122-7032毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);模式:恒定流量;加熱器:250 ℃;壓力13.06 psi;分流流量:23.3 mL·min-1;升溫程序:150 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至230 ℃,保持10 min。檢測(cè)器溫度:250 ℃;進(jìn)樣量:0.2 μL;溶劑推遲:2 min;載氣(He)流量:40 mL/min;分流比20∶1。

質(zhì)譜條件(MS):電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;傳輸線溫度275 ℃;離子源溫度200 ℃;母離子m/z 285;激活電壓1.5 V;質(zhì)量掃描范圍m/z 30～450。檢索譜庫(kù)為NIST。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 文中每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次(感官評(píng)價(jià)除外),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,運(yùn)用Microsoft Excel 2013對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與制表,Origin 7.5軟件(OriginLab公司)作圖,SPSS17.0軟件(IBM公司)進(jìn)行顯著性分析,p<0.05為顯著。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由GC-MS分析軟件系統(tǒng)完成,通過(guò)檢索NIST11質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行定性,未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索的同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照相匹配,匹配度大于80(最大值為100)的作為鑒定結(jié)果。物質(zhì)的相對(duì)百分含量按峰面積歸一化法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)蠶蛹酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

美拉德反應(yīng)是還原糖和氨基酸、肽或蛋白質(zhì)之間的非酶反應(yīng),也是形成大多數(shù)風(fēng)味化合物的主要途徑,可以改善食品的色、香、味[14]。不同處理的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)如表2所示,由表2可知,無(wú)論是桑蠶蛹還是柞蠶蛹,都是脂肪酶預(yù)處理加雞油組的風(fēng)味最好,總分最高的是柞蠶蛹脂肪酶預(yù)處理加雞油(81.8)和桑蠶蛹脂肪酶預(yù)處理加雞油(79.1)?？傮w而言,脂肪酶預(yù)處理組與對(duì)照組相比,在組織形態(tài)和滋味方面存在顯著差異(p<0.05),在色澤和氣味方面存在顯著差異;而添加雞油組與對(duì)照組相比,在滋味方面存在顯著差異(p<0.05),在色澤、組織形態(tài)和氣味方面評(píng)分與對(duì)照組相差不大;既有脂肪酶預(yù)處理又添加雞油組與對(duì)照組相比,在色澤、組織形態(tài)、氣味和滋味四個(gè)方面都存在顯著性優(yōu)勢(shì)(p<0.05)。綜合得分情況,兩種處理組>單個(gè)處理組>空白對(duì)照組。這表明一定量的脂肪酶處理和雞油的添加都能對(duì)蠶蛹呈味肽的感官評(píng)價(jià)產(chǎn)生積極的影響,而兩者共同作用的效果更為明顯。

表2 不同處理的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)Table 2 Sensory evaluation results of Maillard reaction products

2.2 不同處理對(duì)蠶蛹酶解液水解度的影響

水解度是反映蛋白質(zhì)水解程度的一個(gè)重要指標(biāo),水解度的不同會(huì)引起酶解產(chǎn)物氨基酸組成的差異,從而影響風(fēng)味物質(zhì)的形成[15]。脂肪酶預(yù)處理與空白對(duì)照組的水解度如圖1所示,在360 min時(shí),柞蠶蛹加酶的水解度最高(26.21%),依次為:柞蠶蛹加酶(26.21%)>柞蠶不加酶(24.22%)>桑蠶蛹加酶(23.83%)>桑蠶蛹不加酶(22.41%)。在120 min后,脂肪酶預(yù)處理組的水解度與對(duì)照組相比存在顯著性差異(p<0.05),處理組的水解度明顯大于對(duì)照組。Gustavo L L S等[16]發(fā)現(xiàn),脂肪酶酶解脂肪,使得一部分與脂肪結(jié)合的蛋白質(zhì)基團(tuán)暴露出來(lái),進(jìn)一步酶解,使水解度增大。這表明脂肪酶的預(yù)處理有助于蠶蛹蛋白水解,使蠶蛹蛋白水解度增大。

圖1 不同處理對(duì)蠶蛹酶解液水解度的影響Fig.1 Influence of the pupa enzymatic hydrolysis with different methods

2.3 不同處理對(duì)美拉德反應(yīng)氨基酸組成的影響

蛋白質(zhì)在酶的水解作用下,最終變成小分子的短肽和游離氨基酸,而短肽和游離氨基酸都是參與美拉德反應(yīng)的重要物質(zhì)[17]。八種處理方式制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物氨基酸組成如表3所示,八種處理中LCOOSC組(柞蠶蛹脂肪酶預(yù)處理加雞油)的鮮甜味氨基酸占總鮮甜味氨基酸的比例最高(45.58%),與對(duì)照組OSC組(柞蠶蛹不加脂肪酶酶不加雞油)相比,鮮甜味氨基酸占總氨基酸的比例顯著提高(p<0.05),這與感官評(píng)價(jià)脂肪酶處理和雞油添加能顯著提高呈味肽風(fēng)味的結(jié)果相一致。類(lèi)似的,第LCOSC組(桑蠶蛹脂肪酶預(yù)處理加雞油)相比第SC組(桑蠶蛹不加脂肪酶不加雞油),鮮甜味氨基酸占總氨基酸的比例顯著提高(p<0.05)。說(shuō)明脂肪酶和雞油共同作用,能使美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的鮮甜味氨基酸占總氨基酸比例顯著提高(p<0.05),與前面感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。

表3 不同處理對(duì)蠶蛹美拉德反應(yīng)產(chǎn)物氨基酸組成的影響Table 3 Influence of the amino analysis of MRPS with different methods

2.4 不同處理對(duì)蠶蛹酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

蠶蛹美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)較為復(fù)雜,種類(lèi)頗多,其中最重要的呈味物質(zhì)是醛、吡嗪、酮、呋喃以及其它化合物。

由脂質(zhì)氧化、熱降解產(chǎn)生的,醛類(lèi)化合物是肉香成分中的特征化合物之一[18]。8組試驗(yàn)樣品鑒定出的醛類(lèi)化合物中，壬醛和異戊醛含量較高,壬醛具有玫瑰和柑橘芳香,異戊醛則是亮氨酸發(fā)生Strecker降解產(chǎn)生的,具有巧克力香味,是咖啡、巧克力、牛奶、雞肉等食物的關(guān)鍵香氣成分之一[19]。低含量的醛可以賦予產(chǎn)品脂香風(fēng)味。

其次,樣品檢測(cè)到的吡嗪類(lèi)化合物種類(lèi)也較多,主要有2-甲基吡1嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪。吡嗪類(lèi)物質(zhì)是美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物,其閾值低,具有堅(jiān)果香、焦香和基本的烤肉香,是對(duì)肉香味形成貢獻(xiàn)較大的化合物[20],在檢測(cè)到的吡嗪類(lèi)化合物中2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,6-二甲基吡嗪含量較高,2,5-二甲基吡嗪具有烤香和肉香,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪具有堅(jiān)果香。其中低分子肽(<500Da)是吡嗪類(lèi)化合物產(chǎn)生的主要貢獻(xiàn)者。脫襯模擬處理樣品中吡嗪類(lèi)物質(zhì)的減少,可能是由于酶解液中肽類(lèi)氨基酸的減少。Scalone GL[21]等研究發(fā)現(xiàn),寡肽的存在可以顯著增加吡嗪類(lèi)化合物的含量,游離氨基酸對(duì)生成吡嗪類(lèi)物質(zhì)則貢獻(xiàn)較少。

酮類(lèi)及醇類(lèi)化合物的呈味閾值較高,因此對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)不大。酯類(lèi)呈味閾值低,也是反應(yīng)產(chǎn)物的主要呈味物質(zhì)[22],其中乙醇酸乙酯、2-羥乙基甲酸酯及丁酸甲酯的含量較高。呋喃類(lèi)化合物因其大都具有強(qiáng)烈的肉香及極低的香氣閾值,而幾乎存在于所有的食品香味中。不同處理樣品均檢出了2-戊基呋喃,該物質(zhì)閾值低(4ppb),具有烤味、蔥香味,是動(dòng)物脂質(zhì)熱氧化生成的常見(jiàn)風(fēng)味物質(zhì)之一[23]。此外,還檢測(cè)出了較多的其它揮發(fā)性化合物,其中二甲基三硫具有肉香、洋蔥和蔬菜香氣,且閾值極低[24];十一烷具有雜醇?xì)馕?含量很高,但烷烴呈味閾值較高[25],因此推測(cè)其對(duì)呈味有一定的貢獻(xiàn),但對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。

表4 桑蠶蛹美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要風(fēng)味成分的種類(lèi)歸屬及相對(duì)含量Table 4 The kinds of classification and relative percentage of Silkworm pupa Maillard reaction product

表5 柞蠶蛹美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要風(fēng)味成分的種類(lèi)歸屬及相對(duì)含量Table 5 The kinds of classification and relative percentage of Oak Silkworm pupa Maillard reaction product

總體而言,脂肪酶處理組與對(duì)照組相比,吡嗪類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量都有所增加,存在顯著性差異(p<0.05)。

雞油添加組與對(duì)照組相比,醛類(lèi)和呋喃類(lèi)物質(zhì)的含量有所增加,存在顯著性差異(p<0.05)。而脂肪酶處理和雞油添加組與對(duì)照組相比,醛類(lèi)、吡嗪類(lèi)、呋喃類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)和含量都顯著性增加(p<0.05),而這三類(lèi)物質(zhì)都對(duì)呈味肽的風(fēng)味有積極正面的影響。說(shuō)明脂肪酶處理和雞油添加能使蠶蛹呈味肽的主要風(fēng)味成分顯著提高(p<0.05)。

3 結(jié)論

脂肪酶預(yù)處理和雞油添加兩種處理方式均能在一定程度上改善呈味基料的感官特性,其中柞蠶蛹脂肪酶預(yù)處理加雞油處理的最終產(chǎn)物風(fēng)味最好,評(píng)分為81.8。脂肪酶預(yù)處理和雞油添加共同作用,能使蠶蛹呈味肽中鮮甜味氨基酸占總氨基酸的比例顯著提高。其中最高的為第8組(柞蠶蛹脂肪酶預(yù)處理加雞油),鮮甜味氨基酸占總氨基酸的比例為45.58%。脂肪酶處理和雞油的添加可以顯著提高蠶蛹呈味肽中醛類(lèi)、吡嗪類(lèi)和呋喃類(lèi)等主要風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和含量,從而提高蠶蛹呈味肽的整體風(fēng)味。

本文沒(méi)有涉及蠶蛹脫脂處理的風(fēng)味研究,有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究蠶蛹脂肪對(duì)呈味肽風(fēng)味的影響。