超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶條件 確定及其對凝膠載體結構的影響

鄭德娟,解久瑩,丁 琳,程 磊,曹雁平,,*

(1.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048; 2.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學,北京 100048; 3.北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048)

近年來,固定化酶技術應用廣泛,固定化酶在藥物代謝、抗生素生產(chǎn)、食品工業(yè)等領域廣泛應用,具有制備簡單、酶活性高、易于與底物分離、應用廣泛等優(yōu)點[1]。海藻酸鈉是一種由1,4-聚-B-D-甘露糖醛酸和A-L-古羅糖醛酸組成的線性聚合物,具有良好的生物相容性和降解性,可在溫和條件下實現(xiàn)對蛋白質(zhì)等生物大分子的包埋[2]。超聲是一種物理能量機械波,其在與介質(zhì)作用時,產(chǎn)生一系列包括空化效應、機械效應和熱效應在內(nèi)的超聲效應,并使介質(zhì)發(fā)生物理、化學變化[3]。國內(nèi)外研究者針對超聲對固定化酶酶活性的影響做了大量研究,發(fā)現(xiàn)超聲能夠強化固定化酶的酶活性。吳葛洋等[4]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理后的殼聚糖-海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶酶活力提高,但對其最適溫度與最適pH沒有影響,最大反應速率Vmax提高,Km值下降,超聲場使酶與底物的親和力增加。Stephen等[5]研究發(fā)現(xiàn)高強度超聲處理可以使α-淀粉酶和糖化酶催化反應速率明顯升高,并且減少分子內(nèi)部和分子間的抑制和破壞,能促進底物分子之間的相互作用,強化反應物進入及生成物離開酶活性中心的傳質(zhì)過程,提高酶活性。黃正華等[6]研究發(fā)現(xiàn)超聲能夠影響海藻酸鈉凝膠中酪蛋白的擴散性質(zhì)及凝膠結構,且擴散與凝膠結構之間存在密切關系。有關超聲強化固定化酶酶活性的機制僅涉及超聲對其動力學、擴散的研究,固定化酶酶活性與凝膠結構之間關系的研究未見報道。

本文在單因素實驗基礎上,利用設計均勻試驗獲得超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶酶活性的最佳超聲條件。進一步研究不同超聲頻率、功率對海藻酸鈉凝膠結構的影響,并利用電子顯微鏡與圖像數(shù)字化處理技術定量評價凝膠結構變化程度,考察超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶活性最優(yōu)條件與凝膠結構變化的一致性。本研究成果將為進一步研究超聲對固定化酶的影響機理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三羥甲基氨基甲烷(Tris) 美國Sigma公司,生化試劑;鹽酸、海藻酸鈉、無水氯化鈣、無水碳酸鈉、三氯乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉 國藥集團化學試劑有限公司,化學純;干酪素 北京奧博星生物技術有限責任公司,生化試劑BR;L-谷胱甘肽 北京拜爾迪生物技術有限公司,生化試劑;福林酚試劑 美國Sigma公司,分析純;木瓜蛋白酶(測定活力 4.96×105U/g) 美國Sigma公司,生化試劑。

電子天平、分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;pH計 上海三信儀表廠;智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司;JXD-02型多頻槽式處理系統(tǒng) 北京金星超聲波技術設備有限公司;DC-2006型低溫恒溫水浴鍋 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司;CR22G離心機 HITACHI公司;UVmini-1240型紫外可見分光光度計 日本島津公司;Beta 1-8 LDplus真空冷凍干燥機 德國Christ公司;FEI QUANTA250型掃描電鏡 QUANTA250 FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的制備 稱取4 g海藻酸鈉溶于100 mL Tris-鹽酸緩沖液(0.1 mol/L、pH5.87)中,在60 ℃水浴條件下磁力攪拌至溶解均勻,冷卻至55 ℃左右,加入0.05 g木瓜蛋白酶,攪拌均勻,用一次性滴管滴入0.8 mol/L CaCl2溶液中,置于4 ℃冰箱冷藏0.5 h。取出后用去離子水洗去凝膠表面多余CaCl2,晾干表面水分。

1.2.2 超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶條件的確定 為考察超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶活性條件與凝膠結構變化的一致性,以相對酶活力為指標,研究單因素條件下超聲對海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶相對酶活力的影響特點,在此基礎上采用均勻設計試驗法獲得超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的最佳條件。

1.2.2.1 超聲處理海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶 取1 g固定化木瓜蛋白酶,3 mL谷胱甘肽,10 mL酪蛋白溶液(10 g/L),在40 kHz,40 ℃、0.15 W/cm2條件下處理40 min,測定并計算相對酶活力。

1.2.2.2 單因素實驗設計 取1 g固定化木瓜蛋白酶,3 mL谷胱甘肽,10 mL酪蛋白溶液(10 g/L),在不同超聲頻率(由于儀器限制,選取28、40、50、135 kHz),40 ℃、0.15 W/cm2條件下處理40 min;不同超聲功率(0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2),40 ℃、40 kHz條件下處理40 min;不同超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃),0.15 W/cm2、40 kHz條件下處理40 min;在0.15 W/cm2、40 kHz、40 ℃超聲條件下處理不同時間(20、30、40、50、60 min),測定并計算相對酶活力。

1.2.2.3 超聲處理海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶條件的優(yōu)化 選取超聲頻率、功率、溫度、時間四個因素,利用DPS軟件設計混合水平均勻試驗優(yōu)化超聲條件,實驗設計見表1。

表1 超聲條件的優(yōu)化選擇Table 1 Optimization of ultrasonic conditions

1.2.3 海藻酸鈉凝膠膜的制備 為能夠考察超聲處理對凝膠結構的影響,需要觀察凝膠斷面的結構變化。為此,需要制成海藻酸鈉凝膠膜,以便于在凍干后脆斷。

稱取4 g海藻酸鈉溶于100 mL Tris-鹽酸緩沖液(0.1 mol/L、pH5.87)中,60 ℃水浴條件下磁力攪拌至溶解并攪拌均勻,冷卻至55 ℃左右,倒入裝有0.8 mol/L CaCl2溶液的容器中,置于4 ℃冰箱中冷藏12 h。取出后用去離子水洗去凝膠表面多余CaCl2,晾干表面水分。

1.2.4 超聲處理海藻酸鈉凝膠膜 將凝膠膜放在盛有300 mL PBS溶液(pH7)1000 mL燒杯中,在不同超聲功率(0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2),40 kHz;不同超聲頻率(28、40、50、135 kHz),0.45 W/cm2;70 ℃條件下處理20 min,晾干表面水分后冷凍干燥處理。

非超聲處理的對照組將海藻酸鈉凝膠膜放在盛有300 mL PBS溶液(pH7)1000 mL燒杯中,在70 ℃條件下處理20 min,晾干表面水分后冷凍干燥處理。

以上每個樣品做三組平行。利用掃描電子顯微鏡和圖像數(shù)字化處理技術評價凝膠結構變化。

1.2.5 檢測與評價

1.2.5.1 蛋白酶酶活力的測定 參照福林酚法測定海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶酶活力[7-9]。

反應條件參考1.2.2,反應完成后,加入5 mL三氯乙酸(0.4 mol/L)溶液,終止反應,搖勻后靜置離心,分別取1 mL上清液放入3支試管中,加入5 mL碳酸鈉溶液(0.4 mol/L)及1 mL福林酚試劑,37 ℃保溫顯色20 min,利用紫外分光光度計(波長680 nm)測定吸光度,計算酶活力。

酶活力單位定義:一個活力單位(U)為在1 min內(nèi)催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸的酶量。固定化酶活力單位根據(jù)載體質(zhì)量以U/g表示。

1.2.5.2 相對酶活力的計算

式中:E1表示超聲條件下固定化木瓜蛋白酶酶活力;E0為非超聲條件下固定化木瓜蛋白酶酶活力。

1.2.5.3 定量評價超聲對海藻酸鈉凝膠結構影響 掃描電鏡放大100倍觀察1.2.4中所做樣品凝膠表面結構。再液氮脆斷凝膠膜,掃描電鏡放大100倍觀察凝膠斷面結構。利用專業(yè)圖像分析軟件Image Pro-Plus,測量凝膠膜表面陰暗區(qū)的面積和視野觀察區(qū)面積,凝膠膜表面陰暗區(qū)面積與視野觀察區(qū)面積百分比就是凝膠膜表面的比表面積。測量凝膠膜截面孔隙面積和視野觀察區(qū)面積,凝膠膜截面孔隙面積與視野觀察區(qū)面積的百分比就是凝膠截面的比表面積[7]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗做3次平行,實驗結果為3組平行實驗數(shù)據(jù)的平均值。采用DPSv15.10數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成均勻試驗設計及處理均勻試驗數(shù)據(jù)。采用Image Pro-Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析處理掃描電鏡圖像。數(shù)據(jù)統(tǒng)計差異比較及分析采用Microsoft Excel 2010及Origin 9.0軟件。

2 結果與分析

2.1 超聲頻率對海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶酶活性的影響

2.1.1 超聲頻率對海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶酶活性的影響 圖1表示相同超聲功率、溫度、時間條件下海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶相對酶活力隨著超聲頻率增加的變化趨勢。

圖1 超聲頻率對固定化酶相對酶活力的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on the relative enzyme activity of immobilized papain

由圖1可知,海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的相對酶活力隨著超聲頻率的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當超聲頻率為40 kHz時達到最大,相對酶活力為223.24%±9.8%。超聲的空化效應可以影響固定化酶凝膠載體的結構、酶的結構、底物分子結構、分子的傳質(zhì)等,空化效應越強,影響越大。一般來說頻率增高聲波膨脹時間變短,空化核尚未增長到可產(chǎn)生空化效應的空化泡的大小,或者即使空化泡形成但由于壓縮時間短,空化泡還來不及收縮至發(fā)生崩塌,以致空化效應并不明顯,低頻時聲周期長,空化泡所能達到的最大半徑增大,崩潰時更劇烈,但是,頻率過低氣泡存活時間過長,泡內(nèi)自由基又很容易互相結合而失去活性,所以在一定的操作參數(shù)下有一個合適的頻率值,使酶活力達到最大[10]。

2.1.2 超聲功率對海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶酶活性的影響 由圖2可知,海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的相對酶活力隨著超聲功率的增加而增加,當功率達到0.45 W/cm2,相對酶活力最大,為301.79%±5.43%。王超等[11]研究發(fā)現(xiàn)在135 kHz超聲頻率條件下,殼聚糖-海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶相對酶活力隨超聲功率的增大先增大后減小,在0.35 W/cm2功率處達到最大值。與本文研究結果不同,分析認為可能原因是,由于超聲頻率不同或者凝膠載體不同,凝膠強度不同,導致超聲對固定化酶影響不同。

圖2 超聲功率對固定化酶相對酶活力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the relative enzyme activity of immobilized papain

2.1.3 超聲溫度對海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶酶活性的影響 由圖3知,隨著溫度的升高,固定化木瓜蛋白酶的相對酶活力呈先上升后降低的趨勢,在50 ℃條件下,相對酶活力最大,為274.67%。從實驗結果來看,在較低溫度條件下,超聲強化固定化木瓜蛋白酶活性對溫度變化更為敏感。白鴿等[12]研究發(fā)現(xiàn)在40 kHz,0.15 W/cm2超聲條件下改性明膠固定化木瓜蛋白酶相對酶活力隨超聲溫度的升高先增大后減小,在40 ℃達到最大值。與本文結果趨勢一致。

圖3 超聲溫度對固定化酶相對酶活力的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the relative enzyme activity of immobilized papain

2.1.4 超聲時間對海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶酶活性的影響 時間是影響超聲強化固定化木瓜蛋白酶活性的一個重要因素。由圖4知,隨著時間的延長,固定化木瓜蛋白酶的相對酶活力呈先上升后降低的趨勢,時間為30 min時,相對酶活力最大。在選取時間范圍內(nèi),時間過短,超聲對固定化木瓜蛋白酶影響或未達到預期效果;時間過長,固定化酶活力雖仍呈上升趨勢,但是超聲處理固定化酶的酶活力上升幅度低于非超聲條件下的固定化酶,相對酶活力減小,即超聲強化效果減弱。實驗結果證明,在較短時間條件下,超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶活性效果更明顯。

圖4 超聲時間對固定化酶相對酶活力的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the relative enzyme activity of immobilized papain

2.1.5 超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶活性條件的優(yōu)化 由表2可得，通過均勻試驗,采用偏最小二乘回歸分析,以固定化酶相對酶活力為指標優(yōu)化得到當超聲頻率40 kHz、超聲功率0.45 W/cm2、超聲時間20 min、超聲溫度70 ℃時,相對酶活力最佳的超聲條件,預測相對酶活力為342.64%,驗證試驗結果為370.88%±8.24%。

表2 均勻試驗結果表Table 2 Results of uniform test

2.2 不同超聲條件對海藻酸鈉凝膠結構影響

2.2.1 不同超聲頻率對海藻酸鈉凝膠結構影響 由圖5、圖6知,隨著超聲頻率的增加,凝膠表面粗糙程度先變大后減小,凝膠膜截面孔隙逐漸變得狹長、均勻。由圖7知,隨著超聲頻率的增加,凝膠膜表面及截面的比表面積都呈先增大后減小趨勢,在超聲頻率40 kHz處,凝膠比表面積達到最大值。Chen研究發(fā)現(xiàn)過高的超聲頻率產(chǎn)生的空化氣泡過大,最終導致空化作用效果的減退[13]。

圖5 不同超聲頻率處理下海藻酸鈉凝膠表面的表觀形貌(100×)Fig.5 Scanning electron microscope(SEM)of the surface of calcium alginate gels film by different frequency of ultrasound pretreatment(100×)注:(1)非超聲條件;(2)28 kHz;(3)40 kHz;(4)50 kHz;(5)135 kHz,圖6同。

圖6 不同超聲頻率處理下海藻酸鈉凝膠橫截面的表觀形貌(100×)Fig.6 Scanning electron microscope(SEM)of the cross section of calcium alginate gels film by different frequency of ultrasound pretreatment(100×)

圖7 不同超聲頻率處理下海藻酸鈉 凝膠表面與截面的比表面積Fig.7 Effect of ultrasonic frequency on area ratio of alginate gel

比較圖1、圖7可知,隨著超聲頻率的增大,固定化酶相對酶活力與凝膠比表面積都呈先上升后降低的趨勢,在40 kHz處達到最大值。

2.2.2 不同超聲功率對海藻酸鈉凝膠結構影響 圖8、圖9分別為海藻酸鈉凝膠表面與截面的掃描電鏡圖,隨著超聲功率增大,海藻酸鈉凝膠膜表面破壞程度增大,截面孔隙增大且越來越均勻,孔隙壁破壞程度增大。對比圖10可以看出隨著超聲功率增加,凝膠的比表面積呈增大趨勢,在功率為0.45 W/cm2處達到最大值。隨著超聲功率的增加,超聲的空化效應及機械效應加強,生成的氣泡崩裂越劇烈,對凝膠結構影響越大。

圖9 不同超聲功率處理下海藻酸鈉凝膠橫截面的表觀形貌(100×)Fig.9 Scanning electron microscope(SEM)of the cross section of calcium alginate gels film by different power of ultrasound pretreatment(100×)

圖10 40 kHz超聲不同功率處理下海藻酸鈉 凝膠表面與截面的比表面積Fig.10 Effect of ultrasonic power on area ratio of alginate gel

比較圖2、圖10可見,隨著超聲功率的增大,固定化酶相對酶活力與凝膠比表面積都呈上升的趨勢,在0.45 W/cm2處達到最大值。

3 結論

本文主要研究超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶活性與超聲對凝膠載體結構影響之間的關系。研究證明超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶活性與超聲對凝膠結構的影響有著密切的聯(lián)系。隨著超聲頻率增加,海藻酸鈉凝膠比表面積及固定化木瓜蛋白酶的相對酶活力呈先增大后減小的趨勢,在40 kHz處達到最大值;隨著超聲功率的增加,海藻酸鈉凝膠的比表面積及固定化酶相對酶活力都呈上升趨勢,在0.45 W/cm2處達到最大值。優(yōu)化試驗表明,超聲強化海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶活性的最佳條件為40 kHz、0.45 W/cm2、70 ℃、20 min,在此條件下,凝膠比表面積達到最大值。結果表明,不同超聲條件對凝膠結構的影響與強化海藻酸鈉固定化酶活性的變化結果相一致。凝膠比表面積的增大可能影響酶在凝膠載體中的分布或使反應體系的傳質(zhì)更加容易,酶與底物更容易結合或解除產(chǎn)物抑制作用,強化固定化酶活力。上述研究結果驗證了超聲強化固定化酶活性與超聲對凝膠結構的影響有著密切的聯(lián)系。

超聲影響固定化酶活性是一個復雜的過程,需要進一步研究固定化酶活性位點、底物結構、酶分布、酶結構以及穩(wěn)定性的影響。

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