菰黑粉菌中尿素水解酶基因UeUal的克隆及表達(dá)分析

葛倩雯,張雅芬,葉子弘,俞曉平

(中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310018)

茭白(Zizanialatifolia),古稱(chēng)“菰”.由于其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而深受人們的喜愛(ài)[1].在田間,茭白主要有三種表型：會(huì)抽穗開(kāi)花的雄茭,肉質(zhì)莖飽滿(mǎn)白嫩的正常茭以及切開(kāi)后充滿(mǎn)灰色冬孢子堆的灰茭.研究發(fā)現(xiàn),茭白肉質(zhì)莖膨大是由于其內(nèi)生真菌——菰黑粉菌(Ustilagoesculenta)的侵染增殖引起的.其中未膨大的雄茭中未檢測(cè)到菰黑粉菌的存在,而在莖基部膨大的灰茭和正常茭中,其抽穗開(kāi)花均受到抑制,且灰茭植株中營(yíng)養(yǎng)缺乏且茭肉的薄壁組織細(xì)胞分裂緩慢,液泡化明顯,氧化脅迫程度高.另外,灰茭中菌絲細(xì)胞與寄主細(xì)胞表面凹陷處形成了一個(gè)包含內(nèi)外兩層基質(zhì)的隔膜：正常茭白組織細(xì)胞的外層基質(zhì)更厚,灰茭組織細(xì)胞的內(nèi)層基質(zhì)更透明.進(jìn)一步研究表明,菰黑粉菌的菌株致病力分化致使其與茭白植株互作差異從而導(dǎo)致田間灰茭和正常茭的產(chǎn)生[2].在正常茭中分離得到的菰黑粉菌菌株稱(chēng)為MT(mycelia-teliospore)型菰黑粉菌,多以菌絲態(tài)出現(xiàn),且在茭白膨大后期才出現(xiàn)少量冬孢子;從灰茭中分離得到的菌株稱(chēng)為T(mén)(teliospore)型菰黑粉菌,在茭白膨大過(guò)程中主要以冬孢子的形式存在[3].大量研究表明：T型與MT型菰黑粉菌在致病力上存在顯著差異,其中MT型菌株對(duì)環(huán)境更為敏感[4-6].

菰黑粉菌屬于擔(dān)子菌亞門(mén)黑粉菌屬,與玉米瘤黑粉菌近源,是典型的二態(tài)性真菌[7].有研究發(fā)現(xiàn)：玉米瘤黑粉菌接受植物表面信號(hào)后,異質(zhì)單倍體相互交配融合生成雙核菌絲.雙核菌絲頂端產(chǎn)生附著胞后可直接穿透寄主表皮,待成功入侵寄主后菌絲在寄主細(xì)胞間隙增長(zhǎng),并引起侵染部位細(xì)胞膨大,組織出現(xiàn)瘤變.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)酵母型玉米瘤黑粉菌沒(méi)有侵染能力,其轉(zhuǎn)變成雙核菌絲后才具有侵染能力.而在茭白膨大過(guò)程中,同樣伴隨著菰黑粉菌在茭白植株內(nèi)形成大量雙核菌絲的現(xiàn)象.近期,我們對(duì)菰黑粉菌的生活史研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)兩個(gè)性親和的單倍體相遇后才能形成具有侵染能力的雙核菌絲.而菰黑粉菌雙核菌絲的生成是其侵染茭白植株的關(guān)鍵步驟[4].因此我們推測(cè)：與玉米瘤黑粉菌類(lèi)似,菰黑粉菌的二型態(tài)轉(zhuǎn)換能力的差異是其致病力差異的主要影響因子.

為了明確菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵影響因子,我們進(jìn)行了不同碳氮源條件對(duì)菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換的影響研究,發(fā)現(xiàn)精氨酸能促進(jìn)MT型菰黑粉菌的二型態(tài)轉(zhuǎn)換及菌絲生長(zhǎng),卻抑制了T型菰黑粉菌的二型態(tài)轉(zhuǎn)換及菌絲生長(zhǎng)[4].同時(shí)通過(guò)菰黑粉菌的全基因組測(cè)序結(jié)果分析,在菰黑粉菌中,精氨酸通過(guò)精氨酸酶水解形成尿素,尿素可通過(guò)尿素水解酶進(jìn)一步分解形成CO2.為了進(jìn)一步明確精氨酸對(duì)二型態(tài)轉(zhuǎn)換的作用機(jī)理,我們對(duì)其代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因尿素水解酶進(jìn)行了克隆,并通過(guò)序列比對(duì)、構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)等方法確定了菰黑粉菌中編碼尿素水解酶的基因UeUal.利用熒光定量PCR檢測(cè)UeUal在菰黑粉菌融合過(guò)程中相對(duì)表達(dá)量的變化,分析發(fā)現(xiàn)該基因在融合后期菌絲生長(zhǎng)階段表達(dá)量升高,推測(cè)該基因可能在菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換的后期起作用.

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)以龍茭2號(hào)灰茭中分離出的UeT14,UeT55菰黑粉菌菌株以及龍茭2號(hào)正常茭中分離出的UeMT10,UeMT46菰黑粉菌菌株為實(shí)驗(yàn)材料.本實(shí)驗(yàn)中,菰黑粉菌均培養(yǎng)于YEPS(1%酵母提出物,2%蔗糖,2%胰蛋白胨)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度為28 ℃.

1.2 基因克隆

采用CTAB法提取菰黑粉菌基因組DNA(gDNA)[11].使用柱式真菌總RNA提取純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司,NO. B518659)提取菰黑粉菌RNA并用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(南京諾唯贊生物科技有限公司,NO. R212-01)反轉(zhuǎn)錄成cDNA.以菰黑粉菌全基因組數(shù)據(jù)為參考,在NCBI中找到稻瘟菌、玉米黑粉菌、大麥堅(jiān)黑粉菌等近源物種中尿素水解酶的序列,比對(duì)分析該基因在菰黑粉菌中的預(yù)測(cè)序列.根據(jù)預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因的特異性引物UeUal-F、UeUal-R(表1),分別以菰黑粉菌的gDNA和cDNA為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增.克隆得到的片段送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序.

表1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物序列

1.3 生物信息學(xué)分析

用Clone manger軟件進(jìn)行多序列比對(duì),分析UeUal基因cDNA序列與gDNA序列的差異,分析是否含有內(nèi)含子.將UeT14,UeT55,UeMT10,UeMT46菌株DNA為模板克隆得到的UeUal基因序列用Clone manger進(jìn)行多序列比對(duì),分析四個(gè)菌株間序列差異.通過(guò)ExPasy網(wǎng)站預(yù)測(cè)UeUal蛋白分子的理化特征.利用https://web.expasy.org/compute_pi/網(wǎng)站,在線預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量與等電點(diǎn).利用http://smart.embl-heidelberg.de/網(wǎng)站預(yù)測(cè)UeUal基因翻譯的蛋白中的可能的結(jié)構(gòu)域.利用MEGA軟件中近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).

1.4 體外融合實(shí)驗(yàn)

將菰黑粉菌UeT14,UeT55,UeMT10,UeMT46菌株活化,經(jīng)液體培養(yǎng)至OD600約1.0后,用YEPS液體培養(yǎng)基將OD600調(diào)至2.0.各取2 μL菌液進(jìn)行兩兩混合(UeT14和UeT55,或UeMT10和UeMT46)后點(diǎn)樣于YEPS平板上,每隔12小時(shí)在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株融合及菌絲生長(zhǎng)情況,在體式顯微鏡下觀察融合過(guò)程中菌落形態(tài)變化.同時(shí)刮取菌落樣品于2.0 ml離心管內(nèi),液氮速凍20 s后放于-80 ℃冰箱保存,用于后續(xù)基因表達(dá)模式分析實(shí)驗(yàn).

1.5 基因表達(dá)模式分析

將融合過(guò)程中取樣的樣品用柱式真菌總RNA提取純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司,NO.B518659)分別提取總RNA.提取的菰黑粉菌總RNA用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for Qpcr(+gDNA wiper) (南京諾唯贊生物科技有限公司,NO.R212-01) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL):SYBR染液10 μL,Primer-F/R 1 μL,cDNA Template 0.5 μL,加無(wú)菌水至20 μL. 熒光定量PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃延伸30 s,從第二步開(kāi)始做40個(gè)循環(huán),每個(gè)反應(yīng)做3次重復(fù).根據(jù)UeUal基因序列,設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物(表1),以β-Actin為內(nèi)參,檢測(cè)UeUal基因表達(dá)量.將T型菰黑粉菌0 h的樣品作為對(duì)照,分析UeUal基因的在T型菰黑粉菌融合過(guò)程中的表達(dá)模式.將MT型菰黑粉菌0 h的樣品作為對(duì)照,分析UeUal基因在MT型菰黑粉菌融合過(guò)程中的表達(dá)模式.用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)做顯著性差異分析,用Excel作圖得到UeUal基因表達(dá)模式圖.

2 結(jié)果

2.1 UeUal基因的克隆

在三代測(cè)序得到菰黑粉菌全基因組序列基礎(chǔ)上，結(jié)合在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)找到玉米黑粉菌中尿素水解酶基因序列,預(yù)測(cè)得到菰黑粉菌中的同源基因g3060.通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物UeUal-F/UeUal-R,以菰黑粉菌DNA為模板,克隆得到g3060基因的gDNA(圖1).提取菰黑粉菌總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.以cDNA為模板,用特異性引物UeUal-F/UeUal-R克隆得到g3060基因的ORF序列.分別將克隆得到的片段導(dǎo)入大腸桿菌中,送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.通過(guò)clone manager軟件對(duì)gDNA和cDNA進(jìn)行多序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)兩個(gè)序列無(wú)差異,說(shuō)明該基因無(wú)內(nèi)含子.其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為2598 bp,編碼氨基酸序列長(zhǎng)度為865個(gè)氨基酸.經(jīng)ExPasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)對(duì)其編碼的蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)后可知,該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為92.16 kDa,理論等電點(diǎn)為5.74.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),該基因翻譯的蛋白與尿素水解酶蛋白的同源性較高,命名為UeUal(GenBank登錄號(hào)MH230282).

1—2 598 bp長(zhǎng)度的基因組DNA擴(kuò)增片段;2—2 598 bp長(zhǎng)度的cDNA擴(kuò)增片段；M—DNA Maker(DL5000DNA Maker,南京諾唯贊生物科技有限公司,NO.MD102);箭頭所指的都是測(cè)序的條帶.圖1 UeUal基因cDNA和基因組片段擴(kuò)增瓊脂凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of the UeUal cDNA and genomic fragments

分別以菰黑粉菌UeT14,UeT55,UeMT10,UeMT46菌株DNA為模板,克隆UeUal的基因組序列.用Clone manager軟件對(duì)4個(gè)菌株的UeUal基因組系列做多序列比對(duì)后我們發(fā)現(xiàn),如圖2,T型菌株序列兩兩相同,MT菌株序列兩兩相同,但T型與MT型間存在個(gè)別堿基的差異.在ORF編碼框中,個(gè)別堿基的突變也造成了編碼的氨基酸的改變.進(jìn)一步分析ORF編碼框中氨基酸的變化,我們發(fā)現(xiàn)在整個(gè)ORF編碼框中T型與MT型氨基酸序列共存在6處氨基酸的差異,他們分別存在于所編碼的第2、136、214、267、313以及386位氨基酸處(表2).

圖2 菰黑粉菌UeT14,UeT55,UeMT10,UeMT46菌株中UeUal基因序列差異示意圖Figure 2 The difference of UeUal gene sequence in UeT14, UeT55, UeMT10 and UeMT46

氨基酸位置氨基酸變化情況(T型→MT型)第2位組氨酸→酪氨酸第136位亮氨酸→絲氨酸第214位苯丙氨→酸絲氨酸第267位丙氨酸→纈氨酸第313位谷氨酸→谷氨酰胺第386位丙氨酸→蘇氨酸

2.2 UeUal蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析與結(jié)構(gòu)分析

在NCBI上下載得到菰黑粉菌近源物種酵母、玉米黑粉菌、玉米絲黑穗菌等真菌中尿素水解酶蛋白序列.在MEGA軟件中采用Clustal W進(jìn)行序列比對(duì),用近鄰法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).根據(jù)進(jìn)化樹(shù)可知,菰黑粉菌尿素水解酶蛋白與賓地瘤黑粉菌尿素水解酶蛋白間遺傳距離相近(圖3),同源性較高.尿素水解酶是一類(lèi)鎳依賴(lài)的金屬酶.該酶包括α、β和γ三個(gè)亞基,他們可以作為單獨(dú)的蛋白質(zhì)存在,也可以結(jié)合在同一個(gè)蛋白鏈上.每個(gè)尿素水解酶全酶包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域[12-13],包括三個(gè)亞基結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鎳結(jié)合催化域[14].將UeUal蛋白序列放入http://smart.embl-heidelberg.de/進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).菰黑粉菌尿水解酶蛋白中包含尿素酰胺水解酶γ亞基區(qū)域、尿素水解酶α亞基區(qū)域、尿素水解酶β亞基區(qū)域以及1個(gè)酰胺氫區(qū)域(圖4),與前人研究相符合.在該序列編碼的氨基酸鏈的1-100位氨基酸構(gòu)成了一個(gè)尿素水解酶γ亞基區(qū)域,第144-243位氨基酸構(gòu)成了尿素水解酶β亞基區(qū)域,第284-404位氨基酸構(gòu)成了尿素水解酶α亞基區(qū)域,第410-758位氨基酸構(gòu)成了酰胺氫區(qū)域.

注：賓地瘤黑粉菌Melanopsichium pennsylvanicum 4(CDI56612.1),禾柄銹菌Puccinia graminis(XP 003322447.2),新型隱球菌Cryptococcus neoformansJEC21(XP 572365.1),玉米黑粉菌Ustilago maydis 521(XP 011392409.1),玉米絲黑穗菌Sporisorium reilianum SRZ2(CBQ71321.1),大麥堅(jiān)黑粉菌Ustilago hordei(CCF48991.1),釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae(NP 009767.1)圖3 UeUal蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of UeUal protein

圖4 UeUal蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Figure 4 UeUal protein domain prediction

2.3 UeUal基因表達(dá)模式分析

前期研究發(fā)現(xiàn)酵母型菰黑粉菌無(wú)法侵染茭白植株,只有菌絲型菰黑粉菌具有侵染茭白植株的能力.且T型和MT型菰黑粉菌在融合能力、致病力等方面均存在差異.為進(jìn)一步研究UeUal基因?qū)院诜劬诤系挠绊?本研究分別提取T型和MT型菰黑粉菌體外融合實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間段的樣品總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后做熒光定量PCR檢測(cè)UeUal基因的表達(dá)量.將T型菰黑粉菌0 h的樣品作為對(duì)照,分析UeUal基因在T型菰黑粉菌融合過(guò)程中的表達(dá)模式.將MT型菰黑粉菌0 h的樣品作為對(duì)照,分析UeUal基因在MT型菰黑粉菌融合過(guò)程中的表達(dá)模式.從熒光定量PCR的結(jié)果分析我們可以知道,在T型菌株融合過(guò)程中UeUal基因在前期持續(xù)呈低表達(dá)狀態(tài).直至36 h時(shí),UeUal基因表達(dá)量顯著性升高.36 h后,UeUal基因表達(dá)量持續(xù)升高(圖5A).在MT型菌株融合過(guò)程中UeUal基因在前期持續(xù)呈低表達(dá)狀態(tài).直至48 h時(shí),UeUal基因表達(dá)量顯著性升高.48 h后,UeUal基因表達(dá)量仍然顯著性升高(圖5B).結(jié)合菌株融合的表型來(lái)看,T型菌株在36 h時(shí)能夠在體視顯微鏡下觀察到融合菌絲;MT型菌株在48 h時(shí)能夠在體式顯微鏡下觀察到融合菌絲(圖5C).該時(shí)期,UeUal基因表達(dá)量均顯著性升高,推測(cè)該基因可能作用于融合菌絲生長(zhǎng)時(shí)期.

3 討論

茭白作為我國(guó)第二大水生蔬菜,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.菰黑粉菌與茭白互作導(dǎo)致茭白植株莖部膨大形成可食用莖.研究發(fā)現(xiàn),菰黑粉菌由酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)變是其侵染茭白植物的關(guān)鍵.前期研究表明,精氨酸水解產(chǎn)生的尿素可能通過(guò)尿素水解酶水解從而產(chǎn)生CO2,作用于真菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換[8].本文基于菰黑粉菌的全基因組測(cè)序結(jié)果,以模式生物玉米黑粉菌中尿素水解酶序列為參考,預(yù)測(cè)得到了菰黑粉菌中尿素水解酶相關(guān)序列,并設(shè)計(jì)了特異性引物,第一次克隆得到了菰黑粉菌中尿素水解酶基因.通過(guò)同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析確認(rèn),并將其命名為UeUal.進(jìn)一步分析其蛋白結(jié)構(gòu)功能域,發(fā)現(xiàn)該蛋白是一個(gè)完整的尿素水解酶,包含尿素水解酶α、β、γ亞基及鎳結(jié)合催化域(圖4).

A—UeUal基因在T型菰黑粉菌融合過(guò)程中表達(dá)量變化圖;B—UeUal基因在MT型菰黑粉菌融合過(guò)程中表達(dá)量變化圖;C—菰黑粉菌T型與MT型菌株融合菌落顯微圖(Bar=100μm)圖5 UeUal基因表達(dá)模式分析圖Figure 5 Expression analysis of UeUal gene

已經(jīng)有研究表明,精氨酸水解產(chǎn)生的尿素通過(guò)尿素水解酶水解產(chǎn)生的CO2能夠激活Ras調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)響應(yīng)cAMP信號(hào)途徑[15-16],激活白念珠菌二型態(tài)轉(zhuǎn)化開(kāi)關(guān)基因Efg1p,誘導(dǎo)菌絲生成[17-18].為了研究尿素水解酶在菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中的作用,我們分別以T型與MT型融合菌株不同時(shí)間點(diǎn)菌株樣品模板,通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定UeUal基因的相對(duì)表達(dá)量.結(jié)果發(fā)現(xiàn),該基因在融合菌絲生長(zhǎng)階段呈高表達(dá)狀態(tài),且后期呈持續(xù)升高趨勢(shì)(圖5A).推測(cè)該基因可能作用于融合菌絲生長(zhǎng)階段.但是UeUal基因?qū)院诜劬蛻B(tài)轉(zhuǎn)化的影響,以及其是否通過(guò)水解尿素產(chǎn)生CO2來(lái)介導(dǎo)cAMP信號(hào)途徑,從而影響菰黑粉菌的融合能力和侵染能力，仍需要大量實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證.我們有必要通過(guò)分子手段敲除UeUal基因,進(jìn)而對(duì)該基因在菰黑粉菌性親和單倍體間融合能力及菰黑粉菌侵染茭白過(guò)程中的作用做進(jìn)一步驗(yàn)證.