一株降膽固醇乳酸菌的篩選及其在模擬消化環(huán)境活性的研究

范穎，陳思涵 ，黨芳芳，王喆，滿朝新，姜毓君,b

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150030）

0 引 言

近年來，心血管疾病的發(fā)病率逐年攀升[1]，據(jù)報(bào)道，心血管疾病是全球的首要死因，每年死于心血管疾病的人數(shù)多于其他任何死因[2]。相比血脂正常人群，高膽固醇血癥人群發(fā)生心血管疾病的危險(xiǎn)性高出3倍以上[3]。乳酸菌作為重要的益生菌被證實(shí)有多種益生功能，其中，其益生功能之一降低血清總膽固醇得到廣泛研究[4-5]。

本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏及分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品的25株乳酸菌中篩選出一株能高效降膽固醇的植物乳桿菌，對(duì)其在模擬消化環(huán)境中活性進(jìn)行研究，為后續(xù)開發(fā)降膽固醇發(fā)酵乳提供理論基礎(chǔ)作為參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品：干酪乳桿菌TD 085，TD086，TD088；植物乳桿菌TD112，TD113，TD 114；乳明串珠菌TD115，TD116，TD117；羅伊氏乳桿菌TD118和TD119；保加利亞乳桿菌TD121，TD122，TD123。

實(shí)驗(yàn)室保藏：干酪乳桿菌ATCC 393；副干酪乳桿菌 TD102，TD103，TD104；短 乳 桿 菌 TD 107和TD 108；植物乳桿菌TD109，TD110，TD111；嗜酸乳桿菌ATCC 11975和NCFM。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、胰蛋白胨10 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、檸檬酸氫二銨2.6 g、磷酸氫二鉀2.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、Tween-80 1 mL，加水至1 000 mL，pH調(diào)至5.8，121℃滅菌15 min，4℃保存。

MRS-CHOL-THIO培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加0.25%巰基乙酸鈉、質(zhì)量濃度為100μg/mL膽固醇以及0.35 g/100 mL膽鹽，121℃滅菌20 min，4℃保存。

膽固醇，膽鹽，巰基乙酸鈉，鄰苯二甲醛，體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，氫氧化鉀，正己烷，鹽酸，氯化鈉，胃蛋白酶，胰蛋白酶，碳酸氫鈉，均為分析純。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，BCN 1360型生物潔凈工作臺(tái)，低溫冷凍離心機(jī)，高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 降膽固醇菌株篩選

1.2.1.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60μg/mL的膽固醇溶液1 mL，60℃氮吹揮發(fā)盡溶劑，加入質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的鄰苯二甲醛溶液2 mL，緩慢加入濃硫酸1 mL，充分振蕩混勻后，室溫下顯色10 min，于波長550 nm測定吸光值。以膽固醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 膽固醇脫除率測定

將25株菌活化兩代后分別以2%的接種量接種至MRS-CHOL-THIO培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，分別將菌液于4℃，5 000 rpm離心10 min，取上清液1 mL于干凈試管中，加入95%乙醇4 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%的氫氧化鉀溶液3 mL，混勻后，60℃水浴15 min，迅速冷卻至室溫，加入正己烷7 mL，混勻后加入4 mL蒸餾水，漩渦振蕩后室溫靜置至分層。取3 mL上層正己烷層，60℃氮吹揮發(fā)盡溶劑，加入5 mL鄰苯二甲醛溶液，混勻后靜置10 min，緩慢加入3 mL濃硫酸，立即混勻，靜置10 min后，于波長550 nm處測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算膽固醇質(zhì)量濃度，并利用公式計(jì)算膽固醇脫除率，即

膽固醇脫除率=（1－C1/C0）×100%，

式中：C1為菌株接至MRS-CHOL-THIO培養(yǎng)24 h后上清液中膽固醇的質(zhì)量濃度；C0為開始培養(yǎng)之前培養(yǎng)基中膽固醇的質(zhì)量濃度。

1.2.2 環(huán)境耐受性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 耐酸性實(shí)驗(yàn)

菌株于37℃在MRS培養(yǎng)基中活化兩代后制備菌懸液，重懸于用濃度為4.0 mol/L的HCL調(diào)整后p H值為3.0和2.0的MRS培養(yǎng)基中，37℃，分別作用0，1，2，3 h后取菌液；10倍稀釋涂布于MRS固體培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以MRS培養(yǎng)基（pH=5.8）中培養(yǎng)的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率，即

存活率=Nt/N0，

式中：Nt為低pH值MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)；N0為pH值為5.8時(shí)MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)。

1.2.2.2 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

菌株于37℃在MRS培養(yǎng)基中活化兩代后制備菌懸液，重懸于膽酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%，0.5%，1%的MRS培養(yǎng)基；分別作用0，1，2，4 h后取菌液；10倍稀釋涂布于MRS固體培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率，即

存活率=Nt/N0，

式中：Nt為含不同分?jǐn)?shù)膽鹽MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)；N0為MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)。

1.2.2.3 耐鹽實(shí)驗(yàn)

菌株活化兩代后，以2%接種量分別接種至NaCl質(zhì)量濃度分別為0～7 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后取菌液，10倍稀釋涂布于MRS固體培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率，即

存活率=Nt/N0，

式中：Nt為含不同質(zhì)量濃度NaCl培養(yǎng)基中活菌數(shù)；N0為MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)。

1.2.2.4 人工胃液和人工腸液耐受性實(shí)驗(yàn)

菌株于37℃在MRS培養(yǎng)基中活化兩代后制備菌懸液，重懸于人工胃液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35%胃蛋白酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的NaCl，調(diào)整至p H值為3.0，過濾除菌）中，37℃處理0，1，2，3后取菌液，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。之后，取處理3 h后含菌的人工胃液，以2%接種量接種于人工腸液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.1%碳酸氫鈉、0.3%Na-Cl、0.1%胰蛋白酶、0.6%膽鹽，調(diào)整至p H值為 8.0，過濾除菌）中，37℃處理0，3，5，7，8 h后取菌液；進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率，即

存活率=Nt/N0，

式中：Nt為人工胃腸液中活菌數(shù)；N0為MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇能力測定

2.1.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1是膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程是：y=0.0074x+0.0044，R2=0.9951，線性關(guān)系良好，可用于降膽固醇能力的測定。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 不同菌株降膽固醇能力比較

通過鄰苯二甲醛法測定25株乳酸菌對(duì)膽固醇脫除率，結(jié)果如圖2所示。圖2中，膽固醇脫除率小于20%有5株菌，膽固醇脫除率20%～30%有11株菌，膽固醇脫除率30%～40%有6株菌，膽固醇脫除率大于40%有3株菌：植物乳桿菌TD109，植物乳桿菌TD113，嗜酸乳桿菌NCFM，對(duì)膽固醇脫除率分別為47.89%，43.39%，40.63%，其中，植物乳桿菌TD109膽固醇脫除率最高，與居華[6]、丁苗[7]分離出的菌株相比，脫除率相對(duì)較高，因此植物乳桿菌TD109被篩選出用于后續(xù)研究。

圖2 實(shí)驗(yàn)菌株膽固醇脫除率

2.2 耐酸性實(shí)驗(yàn)

菌株能順利定植腸道的前提條件是可耐受胃中的酸性環(huán)境，胃液的p H值會(huì)隨著飲食的攝入與排空發(fā)生不斷變化。在空腹時(shí)，胃液的p H值為0.9～1.8；在攝入食物后，胃液p H會(huì)隨飲食結(jié)構(gòu)變化，約為1.8～5.0，通常會(huì)維持在pH值3.0左右[8]。食物在胃中的停留時(shí)間通常為1～3 h[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取2個(gè)不同pH（2.0和3.0），在作用0，1，2，3 h分別取樣，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，檢測菌株對(duì)酸的耐受性，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，植物乳桿菌TD109在pH值為2.0條件下耐受性較差，處理1 h后，菌落總數(shù)明顯下降，處理2 h后，活菌數(shù)為0；在p H值為3.0條件下有較強(qiáng)耐受性，隨著處理時(shí)間增長，菌落總數(shù)下降緩慢，在處理3 h后活菌數(shù)仍達(dá)到108mL-1。由此說明，植物乳桿菌TD109有耐受胃酸環(huán)境的能力。

圖3 植物乳桿菌TD109對(duì)酸的耐受性

2.3 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

小腸中存在一定濃度的膽鹽，菌株要想在在小腸中發(fā)揮益生作用，需耐受一定濃度的膽鹽。通常人體小腸內(nèi)的膽鹽濃度約為0.3%（w/v）[10]。本實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膽鹽（0.3%，0.5%，1%），在處理0，1，2，4 h后分別取樣，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，檢測菌株對(duì)膽鹽的耐受性，結(jié)果如圖4所示，由圖4可以看出，植物乳桿菌TD109有較強(qiáng)的耐膽鹽能力，在3個(gè)不同濃度作用下，隨著時(shí)間增長，菌落總數(shù)下降緩慢，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%膽鹽處理1，2，4 h后，存活率分別為51.04%，36.77%，24.06%?？梢?，植物乳桿菌TD109有耐受膽鹽能力。

圖4 植物乳桿菌TD109對(duì)膽鹽的耐受性

2.4 耐鹽實(shí)驗(yàn)

隨著飲食變化，體內(nèi)離子濃度會(huì)發(fā)生變化，從而改變?nèi)梭w滲透壓。微生物在等滲溶液中適合生長，在低滲溶液中，無細(xì)胞壁的細(xì)胞會(huì)發(fā)生水溶現(xiàn)象，溶液進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹破裂死亡[11]，而植物乳桿菌作為革蘭氏陽性菌，有較厚的富有韌性的細(xì)胞壁，不會(huì)出現(xiàn)膨脹至破裂的現(xiàn)象，故低滲環(huán)境對(duì)其影響不大；在高滲溶液中，微生物會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離[12]，嚴(yán)重失水，水分是微生物生長非常必要的條件，失水會(huì)抑制微生物生長。人體胃腸道中NaCl質(zhì)量濃度范圍為1～4 g/100 mL[13]。本實(shí)驗(yàn)，將植物乳桿菌TD109分別接入含有NaCl質(zhì)量濃度0～7 g/100mL的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)，檢測菌株耐鹽能力，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，在人體胃腸道中常規(guī)NaCl質(zhì)量濃度4 g/100mL條件下，植物乳桿菌TD109存活率為4.72%。雖然活菌數(shù)隨NaCl濃度增加而降低，但在NaCl質(zhì)量濃度7 g/mL的高鹽濃度下，菌落總數(shù)仍可達(dá)到107mL-1以上?？梢?，植物乳桿菌TD109有耐高鹽環(huán)境的能力。

圖5 植物乳桿菌TD109對(duì)NaCl的耐受性

2.5 耐人工胃液實(shí)驗(yàn)

人體胃液呈酸性，胃蛋白酶在酸性環(huán)境中被激活，可能會(huì)殺死進(jìn)入胃中的細(xì)菌[14]。益生菌要想在胃中發(fā)揮作用，就要有對(duì)酸性和胃蛋白酶的耐受性。本研究選取通常情況下胃中pH值為3.0的條件下[8]，在人工胃液中檢測菌株的耐受性，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，在人工胃液處理1，2，3 h后，植物乳桿菌存活率分別為50.22%，35.72%，13.41%。由此可見，植物乳桿菌TD109對(duì)人工胃液有較強(qiáng)的耐受性。

圖6 植物乳桿菌TD109對(duì)人工胃液的耐受性

2.6 耐人工腸液實(shí)驗(yàn)

食物經(jīng)過胃消化后會(huì)進(jìn)入腸道，腸道中的菌群生長受腸道中多種成分的影響，菌株要想在腸道中發(fā)揮作用，要有耐受小腸中胰蛋白酶及堿性環(huán)境的能力。小腸中pH值約為7.6，一般食物在小腸中停留時(shí)間為3～8 h[14]。本研究選取pH值為8.0的人工腸液處理不同時(shí)間，通過菌落計(jì)數(shù)檢測植物乳桿菌TD109對(duì)人工腸液的耐受性，結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，植物乳桿菌TD109在人工腸液處理3，5，7，8 h后，存活率分別為79.26%，60.37%，50.84%，47.66%?？梢?，植物乳桿菌TD109有耐受人工腸液的能力。

圖7 植物乳桿菌TD109對(duì)人工腸液的耐受性

3 結(jié)論

本研究對(duì)25株乳酸菌進(jìn)行體外降膽固醇能力比較，結(jié)果表明，大部分菌株膽固醇脫除率在20%～30%，其中有3株乳酸菌膽固醇脫除率在40%以上，體外降膽固醇能力最強(qiáng)的是植物乳桿菌TD 109，膽固醇脫除率為47.89%。

通過對(duì)酸、膽鹽、鹽、人工胃液和人工腸液的耐受性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌TD 109在p H值為3.0條件下處理3 h后菌落總數(shù)仍可達(dá)到108mL-1以上；在1%膽鹽處理4 h后存活率可達(dá)24.06%；在7 g/100mL的高鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)后，菌落總數(shù)可達(dá)到107mL-1以上；植物乳桿菌TD109可順利通過胃的消化后進(jìn)入腸道，在人工腸液處理8 h后存活率可達(dá)47.66%。

由以上結(jié)果可見，植物乳桿菌TD109有體外降膽固醇的能力，并且有較強(qiáng)的環(huán)境耐受能力，為后續(xù)進(jìn)一步研究植物乳桿菌TD109降膽固醇機(jī)制研究提供依據(jù)。