醬油中生物胺的形成機(jī)制及其測定

王青華，范桂強(qiáng)，張咚咚

(1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河北 衡水 053000)

生物胺是一類含氨基的低分子質(zhì)量且具有一定生物活性的有機(jī)化合物的總稱，廣泛存在于多種食品中，尤其是魚類及其相關(guān)產(chǎn)品，酒類、肉類、干酪、豆制品及其他發(fā)酵制品中。組胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺、苯乙胺和色胺被認(rèn)為是食物中最普遍的生物胺[1]。

食品中的生物胺由于其潛在的生理和毒性作用對人類健康產(chǎn)生了極大危害。如果攝入過量的生物胺會引起一系列的健康問題，會出現(xiàn)如頭痛、惡心、血壓不穩(wěn)、心悸等癥狀，在各類生物胺中，普遍認(rèn)為對人類健康危害最大的是組胺和酪胺[2,3]。

1 醬油中生物胺的形成

1.1 生物胺的生理作用

組胺在哺乳動物的腦部組織中，在充當(dāng)過敏癥[4]、胃酸分泌[5,6]、神經(jīng)傳遞介質(zhì)化學(xué)調(diào)節(jié)劑方面起到很大的作用[7,8]。當(dāng)食品中組胺含量較低時(shí)，該食品不會被認(rèn)為存在健康風(fēng)險(xiǎn)；在體內(nèi)，長期缺乏組胺和組胺過量都會引起神經(jīng)和生理方面的功能失調(diào)。但當(dāng)攝入量超過1000 mg/kg時(shí)，會直接導(dǎo)致食物中毒如干酪綜合癥等[9,10]，嚴(yán)重的會引起明顯的生理和毒性危害。組胺含量異常會出現(xiàn)明顯的功能失調(diào)癥狀如胃疾病、肥大細(xì)胞癥、骨髓性白血病等[11]。

酪胺，又名p-對羥基苯乙胺，據(jù)報(bào)道，攝入大量含酪胺的食品后會引起明顯的毒性作用[12]。還有文獻(xiàn)說明患有偏頭痛的病人攝入含有酪胺的食品后會加重偏頭痛的病情[13,14]。酪胺還會加速神經(jīng)末梢血管收縮，剌激心律加快，增加血糖濃度。人體攝入酪胺超過100 mg會引起偏頭痛癥狀，超過1080 mg會引起嚴(yán)重的中毒性腫脹。

1.2 醬油中生物胺的形成機(jī)制

從世界范圍看，中國是醬油起源最早的國家，醬油是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵型調(diào)味品，主要是由豆粕、面粉、麩皮和小麥等為原料，在多種微生物主要是曲霉屬真菌作用下發(fā)酵而成的。在醬油制作發(fā)酵過程中，在由米曲霉和大豆疫酶產(chǎn)生的蛋白酶的作用下，原料中的蛋白質(zhì)被水解成小分子的肽類、氨基酸和氨類[15]。醬油特有的風(fēng)味在發(fā)酵和老化過程中逐漸形成，同時(shí)形成了高含量的自由氨基酸，自由氨基酸的產(chǎn)生使醬油產(chǎn)生特有的風(fēng)味，同時(shí)可能也是生物胺潛在的主要來源。

生物胺是醬油在長期發(fā)酵過程中非常容易產(chǎn)生的一類有害物質(zhì)。生物胺主要是由微生物脫羧酶在輔酶5-磷酸吡哆醛的作用下，作用于相應(yīng)的氨基酸，脫去羧基所形成的胺。生物胺的形成需要具備以下條件：存在可以分泌氨基酸脫羧酶的微生物；有相應(yīng)氨基酸的存在；有利于相關(guān)微生物生長，可以提高相應(yīng)脫羧酶活性的環(huán)境。

2 生物胺的檢測方法

目前，檢測生物胺的方法主要是高效液相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法[16]、酶學(xué)測定法[17]等。其中最常用的是高效液相色譜法。由于高效液相色譜法較為成熟，可以同時(shí)測定一類物質(zhì)的多種類物質(zhì)的含量，本方法采用高效液相色譜方法同時(shí)測定最重要的2種生物胺——組胺和酪胺的含量。本研究測定了3種常見市售醬油中的組胺和酪胺含量，為消費(fèi)者的飲食提供了一定的膳食指導(dǎo)。

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1.1 儀器設(shè)備

Agilent 1260液相色譜儀(配紫外檢測器) Agilent公司；渦旋混合器 美國Talboys公司；高速離心機(jī) 日立公司；分析天平。

2.1.2 試劑及材料

乙腈、丙酮、甲醇：均為色譜純；乙酸銨、氨水(25%)、NaHCO3、氫氧化鈉、高氯酸：均為分析純；丹磺酰氯、組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Adrich公司，純度均大于99%；實(shí)驗(yàn)用水：均為雙蒸水，并經(jīng) Milli-Q超純水處理。廚邦味極鮮醬油、廚邦蒸魚豉油、李錦記蒸魚豉油、欣和六月鮮：均購自衡水吉美超市。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

2.2.1 樣品預(yù)處理

分別取2 mL醬油于10 mL離心管中，用0.4 mol/L高氯酸稀釋至刻度，置于渦旋混合器上混合5 min，待用[18]。

2.2.1.1 樣品衍生化

分別吸取0.1 mL樣液注入到螺帽瓶中，加入2 mol/L NaOH 0.2 mL溶液調(diào)節(jié)溶液pH值，飽和 NaHCO3溶液0.3 mL和丹磺酰氯丙酮溶液(10 mg/mL)1.0 mL，將上述混合物在40 ℃條件下于暗處攪拌30 min，然后加少量氨水使多余的丹磺酰氯沉淀，過濾，將上清液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，用乙腈定容至5 mL，過0.45 μm濾膜后進(jìn)行色譜分析。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

稱取一定量的組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品，用 0.4 mol/L 高氯酸配制成濃度為 1 mg/mL 的組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，放于冰箱中4 ℃保存，每周一配。精確稱取適量丹磺酰氯，用丙酮溶解并配制成濃度為 10 mg/mL的溶液，經(jīng)過 0.45 μm 針頭微孔濾膜過濾器過濾后，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1.3 組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化過程

配制濃度為5,20,50,100,200，500 μg/mL的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為2,8,20,40,80，200 μg/mL的酪胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.1 mL含有不同濃度的組胺和酪胺的混標(biāo)溶液，具體衍生過程同2.2.1.1。

2.2.2 色譜條件

色譜條件：Agilent 1100色譜儀，流動相為V(乙腈)∶V(乙酸銨)為80∶20，進(jìn)行等度洗脫；流速：1 mL/min；色譜柱：Waters Nova-Pak C18(250 mm×4.6 mm) Column；配有紫外檢測器；檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫 為40 ℃。

2.3 結(jié)果與討論

2.3.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)過程中選用了甲醇、乙腈、乙酸及乙酸胺等溶液搭配使用來選擇流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈和乙酸銨搭配使用最為合適，本實(shí)驗(yàn)之所以使用等度洗脫和梯度洗脫，是由于實(shí)驗(yàn)中為了優(yōu)化測定色譜條件，減少整個(gè)測定過程的時(shí)間，消除其他干擾物質(zhì)的影響。

考察了柱溫對組胺和酪胺出峰的影響后發(fā)現(xiàn)柱溫變化時(shí)組分出峰順序沒有變化，但分析時(shí)間隨柱溫升高而縮短。

2.3.2 樣品提取

本實(shí)驗(yàn)采用水、鹽酸、甲醇、正丁醇、丙酮、三氯乙酸、高氯酸等溶劑作為提取溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 0.4 mol/L高氯酸溶液提取效果較好，因此選用0.4 mol/L高氯酸溶液作為提取劑。

2.3.3 衍生化過程

本文選用了鄰苯二甲醛、 磺酰氯二甲胺偶氮苯、丹磺酰氯、異硫氰酸苯酯、熒光胺、氯甲酸(9-芴醇)甲酯作為衍生試劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用丹磺酰氯進(jìn)行衍生效果很好，衍生方法也比較簡單。

由于生物胺在弱堿性條件下才能與丹磺酰氯發(fā)生反應(yīng)， 因此樣品在衍生前先用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，再用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié) pH至8.5～9.0。丹磺酰氯衍生在40 ℃條件下反應(yīng)30 min。當(dāng)衍生45，90，150 min實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果顯示在不同的衍生時(shí)間峰面積沒有明顯差異，因此，沒必要進(jìn)行太長時(shí)間的衍生過程。

2.3.4 衍生物的穩(wěn)定性

通過對 2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品衍生物做穩(wěn)定性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)放置在4 ℃、避光條件下，衍生物在2周內(nèi)的峰面積變化不大，但第3周開始峰面積明顯降低。因此，衍生物在4 ℃、避光條件下，可保存2周。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

將上述配制成一系列濃度梯度的組胺和酪胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行進(jìn)樣分析，在以上2種實(shí)驗(yàn)條件下，分別進(jìn)行色譜分析，分別以組胺和酪胺的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在上述2種色譜條件下，組胺在5～500 μg/mL，酪胺在2～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為：

組胺：Y=16.6560+25.1341X，相關(guān)系數(shù)為r=0.99999；酪胺：Y=296.7579+29.3575X，相關(guān)系數(shù)為r=0.99990。

其中，Y為生物胺的峰面積，X為衍生前對應(yīng)的生物胺的濃度。由此可見，峰面積和生物胺濃度呈良好的線性相關(guān)性，測定結(jié)果良好可靠。

圖1 組胺和酪胺混標(biāo)溶液液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of mixed histamine and tyramine solution

2.4 測得的結(jié)果

測定4種市售醬油中組胺和酪胺的含量，結(jié)果見表1。

表1 2種色譜條件下測得的醬油中組胺的含量Table 1 Determination of histamine in soy sauce under two chromatographic conditions

由表1可知，在市售常見的這4種醬油中，廚邦蒸魚豉油中酪胺的含量最高，酪胺的含量為713.54 μg/mL，欣和六月鮮醬油中組胺的含量最高，組胺的含量為522.28 μg/mL。因此，在食用醬油時(shí)，根據(jù)醬油的品牌和種類控制食用量，否則對人體健康會造成很大的危害。

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步評價(jià)2種色譜條件下測定的準(zhǔn)確度和精密度，本研究以廚邦味極鮮醬油為研究對象，在此樣品中分別添加組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成濃度分別為1000,400,200 μg/mL組胺和濃度分別為800，320，160 μg/mL的酪胺加標(biāo)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2和表3。

表2 組胺的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 2 Recovery of histamine under different chromatographic conditions

表3 酪胺的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 3 Recovery of tyramine under different chromatographic conditions

由表2和表3可知，組胺的加標(biāo)回收率在101.61%～112.82%之間，酪胺的加標(biāo)回收率在104.12%～112.92%之間。

3 結(jié)論

該研究針對組胺和酪胺測定的液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，測定了常見的醬油中對人體危害最大的組胺和酪胺的含量，從而可以對不同人群的膳食指導(dǎo)做出一定的貢獻(xiàn)。關(guān)于食品中組胺的允許水平，我國規(guī)定了水產(chǎn)品中組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)[19]，鮐鲹魚類不得高于1000 mg/kg，其他紅肉魚類不得高于300 mg/kg。然而上述大豆發(fā)酵制品、酸奶和啤酒食品中組胺的含量也可能會比較高，我國卻尚未做出相關(guān)的限量規(guī)定，應(yīng)進(jìn)一步完善和健全食品安全標(biāo)準(zhǔn)體系。