蘋果醋發(fā)酵用醋酸桿菌的篩選與鑒定

李華敏，李林，黃萍萍*，劉文麗，潘敏，莊若茹

(1.魯東大學(xué) 食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.煙臺(tái)市糧油質(zhì)量檢測(cè)中心，山東 煙臺(tái) 265301)

果醋是以水果(包括蘋果、葡萄、梨、獼猴桃、柑橘、柿子等)為主要原料，利用酵母菌和醋酸桿菌二次發(fā)酵釀制而成的一種營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸味調(diào)味品，其兼具水果和食醋的營(yíng)養(yǎng)保健性能，有著巨大的市場(chǎng)潛力[1-3]。在眾多果醋中，蘋果醋具有蘋果果香，因其富含醋酸、蘋果酸、琥珀酸和氨基酸等而使醋的風(fēng)味獨(dú)特、酸味適度，同時(shí)蘋果資源豐富，蘋果醋生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，使其成為市場(chǎng)占有率最高的果醋產(chǎn)品[4-7]。蘋果醋有蘋果和食醋的雙重營(yíng)養(yǎng)保健功效，除了具有調(diào)味品的調(diào)酸、增加食欲和抗菌防腐活性外，還具有降血壓、抗衰老、防氧化、促進(jìn)新陳代謝、維持體內(nèi)酸堿平衡等功能[8-10]。蘋果醋的加工生產(chǎn)不僅可以提高蘋果的利用率，更可以延長(zhǎng)蘋果種植業(yè)和加工業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈，從而提高蘋果的附加值，增加經(jīng)濟(jì)效益[11]。

醋酸發(fā)酵過程對(duì)蘋果醋的產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，優(yōu)良的醋酸菌菌種是影響蘋果醋品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[12,13]。目前，國(guó)內(nèi)蘋果醋釀造使用的醋酸菌大都為食醋菌種AS1.41(Acetobacterrancensvar.tubidans)和滬釀1.01(A.pasteurianussubsp.pasteurianus)，不僅產(chǎn)酸能力、耐酒精能力有限，而且發(fā)酵果醋形成的風(fēng)味也不佳，因此需選育優(yōu)良的果醋專用醋酸菌[14,15]。本研究選用煙臺(tái)地區(qū)的蘋果進(jìn)行自然果醋發(fā)酵，從自然發(fā)酵的果醋和果園土壤中篩選醋酸桿菌，以獲得更適合煙臺(tái)蘋果和本地區(qū)氣候的醋酸桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料

紅富士蘋果：采摘于山東煙臺(tái)蘋果園；土壤：取自山東煙臺(tái)蘋果園。

1.2 培養(yǎng)基

醋酸菌富集培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，KH2PO40.5%，pH 5.5，121 ℃滅菌30 min；滅菌后冷卻至70 ℃時(shí)添加3%(V/V)的無(wú)水乙醇。

醋酸菌分離培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，瓊脂2%，CaCO32%，乙醇3%，121 ℃滅菌30 min；CaCO3于165 ℃干熱滅菌30 min，滅菌后添加無(wú)水乙醇和CaCO3。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母粉1%，CaCO32%，瓊脂粉2%，自然pH值。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母粉1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，ZnSO40.01%，乙醇6%，自然pH值。

1.3 試劑

革蘭氏染液：南京建成科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Taq PCR Mastermix、GeneGreen核酸染料、500 bp DNA Ladder：天根生化科技(北京)有限公司；酵母膏、酵母粉、瓊脂粉：均為生化試劑；其他試劑：均為分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司；臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；FE20K pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋、搖床 龍口市先科儀器公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 菌種富集

100 mL鮮榨蘋果汁加入到250 mL無(wú)菌三角瓶中，30 ℃靜止發(fā)酵6周，選醋酸味濃郁的自然發(fā)酵樣品，進(jìn)行分離篩選。

稱取1 g土壤樣品，放入裝有9 mL無(wú)菌水的大試管中，震蕩后靜置5 min，然后將濃度梯度稀釋到10-3，從10-3土壤稀釋液中吸取l mL加入到20 mL富集培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min，培養(yǎng)2～3天。

1.5.2 平板分離

分別取上述富集培養(yǎng)液1 mL，加入到裝有9 mL無(wú)菌水的大試管中，混勻，依次進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，分別取10-5，10-6，10-7稀釋液涂布在分離平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3天。

1.5.3 純化

挑取透明圈較大，菌落形態(tài)一致，生長(zhǎng)占優(yōu)勢(shì)的單菌落劃線純化，30 ℃培養(yǎng)2～3天。

1.5.4 產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)[16]

將分離純化的菌種接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3天，6000 r/min離心5 min，除去發(fā)酵液中的菌體，取5 mL上清液用1 mol/L的NaOH溶液中和至pH為7.0，加入5%的FeCl3溶液5～6滴，煮沸，形成紅褐色沉淀者為醋酸菌。

1.5.5 產(chǎn)酸能力測(cè)定[17]

將上述篩選出的醋酸菌二次活化后，接種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)。比較第5天的產(chǎn)酸量，選出產(chǎn)酸量高的菌株。取2 mL二次培養(yǎng)的菌液，加入50 mL蒸餾水，并滴加2～3滴酚酞試劑，用標(biāo)定的0.1 mol/L NaOH進(jìn)行中和滴定，直到溶液變成淺粉色，由耗用的NaOH溶液的體積計(jì)算樣品中的含酸量(以醋酸計(jì))。

產(chǎn)酸量(g/L)=(V-V0)×CNaOH×60/L。

式中：V為發(fā)酵液樣品滴定耗用的NaOH毫升數(shù)；V0為以空白培養(yǎng)基為對(duì)照滴定耗用的NaOH毫升數(shù)；CNaOH為NaOH溶液的濃度(mol/L)；L為樣品的毫升數(shù)；60為醋酸的分子量。

1.5.6 耐乙醇能力測(cè)定

將菌株接種于50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，30 ℃，120 r/min，培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接入乙醇含量分別為4%，6%，8%，10%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)5天后分別測(cè)定產(chǎn)酸量并比較，每個(gè)菌株做3個(gè)平行。

1.5.7 醋酸菌菌株鑒定[18]

形態(tài)特征觀察：觀察菌株的固體平板菌落形態(tài)，對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞形態(tài)。

基因組DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技)，使用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3')和1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3')擴(kuò)增16S rDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)誤后，PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化、測(cè)序。

1.5.8 醋酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]，進(jìn)而確定其種屬地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與初篩

分離純化：從自然發(fā)酵蘋果醋和蘋果園土壤中共分離篩選到22株透明圈較大(透明圈直徑與菌落直徑的比值大于2)的產(chǎn)酸菌，透明圈結(jié)果見圖1。

圖1 菌落產(chǎn)生的透明圈Fig.1 The transparent circle of colonies

初篩：通過革蘭氏染色和產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中19株菌為革蘭氏陰性菌，并能生成紅褐色沉淀，表明這19株菌為醋酸菌，分別標(biāo)記為YT01～YT19。

2.2 產(chǎn)酸量測(cè)定

測(cè)定19株醋酸菌第5天的產(chǎn)酸量，結(jié)果見表1。

表1 19株菌的產(chǎn)酸量Table 1 The acetic acid yield of 19 strains

由表1可知：YT06，YT10，YT12，YT14和YT17 5株菌的產(chǎn)酸量最大，分別為14.92，15.08，14.18，13.28，16.82 g/L。

2.3 耐乙醇能力測(cè)定

對(duì)以上5株菌的耐乙醇能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 各菌株在不同乙醇濃度下的產(chǎn)酸量Table 2 The acetic acid yield of different strains at different ethanol concentration

由表2可知，這5株菌在乙醇濃度為8%時(shí)，產(chǎn)酸量明顯下降，而在乙醇濃度為6%時(shí)產(chǎn)酸量最大。其中，菌株YT17在6%乙醇濃度下產(chǎn)酸量達(dá)到16.45 g/L。

2.4 產(chǎn)酸曲線測(cè)定

圖2 產(chǎn)酸量曲線Fig.2 The curve of acid yield

對(duì)這5株菌的產(chǎn)酸量進(jìn)行比較，由圖2可知，菌株YT17的產(chǎn)酸量最大，在第8天時(shí)產(chǎn)酸量達(dá)到27.91 g/L，但產(chǎn)酸速度明顯下降。

2.5 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

提取菌株YT06，YT10，YT12，YT14和YT17的全基因組，使用通用引物27F和1492R擴(kuò)增其16S rDNA序列，對(duì)全基因組DNA和PCR擴(kuò)增的16S rDNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3和圖4。PCR產(chǎn)物送交上海生工進(jìn)行純化、測(cè)序。

圖3 菌株基因組DNA電泳結(jié)果Fig.3 Genomic DNA of different strains

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis results of PCR product

2.6 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將5株菌的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載與此序列同源性高的序列，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖5。分離得到的5株醋酸菌按照親緣關(guān)系分屬于3個(gè)種：桃醋酸桿菌(Acetobacterpersici)：YT06；蘋果醋桿菌(Acetobactermalorum)：YT12，YT14；芝庇儂醋桿菌(Acetobactercibinongensis)：YT10，YT17。

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree

3 結(jié)論

本研究從自然發(fā)酵的蘋果醋和蘋果園土壤中篩選到19株醋酸菌，菌株YT06，YT10，YT12，YT14和YT17的產(chǎn)酸能力較好，在乙醇濃度為6%時(shí)產(chǎn)酸量最大，其中菌株YT17在第8天時(shí)產(chǎn)酸量達(dá)到27.91 g/L，對(duì)這5株菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)按照親緣關(guān)系分屬于3個(gè)種：桃醋酸桿菌(Acetobacterpersici)：YT06；蘋果醋桿菌(Acetobactermalorum)：YT12，YT14；芝庇儂醋桿菌(Acetobactercibinongensis)：YT10，YT17。