• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蟾五草組分散組方篩選及體外藥效作用

    2018-10-22 03:03:42陳貴兵
    天津中醫(yī)藥 2018年10期
    關(guān)鍵詞:配基抑制率組分

    陳貴兵

    (成都軍區(qū)總醫(yī)院普外中心,成都 610083)

    蟾皮華蟾毒配基組分是一種有效的抗癌藥物,但具有肝毒性及免疫抑制[1-4]。因其可導(dǎo)致肝細胞壞死和抑制淋巴細胞活性的毒副作用,嚴(yán)重限制了蟾皮華蟾毒配基組分在抗腫瘤方面的應(yīng)用。為實現(xiàn)對蟾皮華蟾毒配基組分的減毒增效,從中醫(yī)經(jīng)方中發(fā)現(xiàn)蟾酥常與甘草、黃芪、五味子配伍以期望達到祛邪不傷正的功效[5-6]。本實驗嘗試根據(jù)組分中藥理論及前期實驗結(jié)果采用中藥組分間配伍以優(yōu)化蟾皮華蟾毒配基組分抗癌作用[1]。

    1 材料和方法

    1.1 儀器與試劑 酶標(biāo)分析儀(北京普朗);細胞增殖與毒性檢測(CCK-8)試劑盒(南京凱基生物)、RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司);蟾皮華蟾毒配基組分、五味子組分、黃芪組分和甘草酸均由中國科學(xué)院大連化物所提供。

    1.2 細胞株 人結(jié)直腸腺癌SW620細胞株和人正常肝細胞L02細胞株系解放軍總醫(yī)院普外研究所凍存。人細胞因子誘導(dǎo)性殺傷T細胞(CIK細胞)參照本實驗室已有方法分離培養(yǎng)獲得[7]。

    1.3 藥液配制 將蟾皮華蟾毒配基組分、五味子組分、黃芪組分和甘草酸以二甲基亞砜(DMSO)充分溶解,加入無血清培養(yǎng)液配制貯存液并用0.22 μm過濾器除菌,-20℃避光保存,控制DMSO終濃度小于0.05%。

    1.4 細胞培養(yǎng) 人SW620和L02細胞株使用高糖DMEM(含10%FBS)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(恒溫培養(yǎng)箱條件37℃、5%CO2),取對數(shù)生長期細胞進行實驗或凍存。人CIK細胞的培養(yǎng)參照本實驗室已有方法[7],實驗前經(jīng)臺盼藍染色鏡下計數(shù)確定活細胞數(shù)>90%。

    1.5 利用析因設(shè)計分析4種藥物組分間的交互作用 選取蟾皮華蟾毒配基組分(A)、五味子組分(B)、黃芪組分(C)和甘草酸(D)作為研究因素,每個因素取兩個水平0和1(0代表無藥,1代表有藥)。4個因素的水平1分別給定藥物終濃度為蟾皮華蟾毒配基組分(A)1 μg/mL、五味子組分(B)10 μg/mL、黃芪組分(C)10 μg/mL 和甘草酸(D)20 μg/mL。將A、B、C、D 分別交叉組合(24),共有 16個實驗方案,分 別 簡 寫 為 A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、ABC、ABD、ACD、BCD、ABCD 和對照組即 A0B0C0D0,見表2。各組藥物劑量為各因素各水平的累加值,然后分別干預(yù)SW620、L02和CIK細胞的增殖。按已有實驗方法接種、培養(yǎng)細胞[1]。16個實驗組均設(shè)3個復(fù)孔,按時完成加藥后培養(yǎng)72 h,取出96孔板光鏡下觀察細胞生長狀態(tài),再每孔加入10 μL CCK-8試劑檢測溶液,置于37℃孵育4 h,選定酶標(biāo)分析儀波長450 ηm處測定各孔吸光度A450值。實驗重復(fù)3次。按下例公式計算細胞增殖抑制率:

    抑制率=(1-藥物組A值/對照組A值)×100%

    1.6 利用正交設(shè)計優(yōu)化組分間配伍劑量 經(jīng)析因?qū)嶒灡砻?種組分間存在交互效應(yīng),確定了藥味組成,但未能明確藥味間的配伍劑量。于是進一步用正交實驗優(yōu)選4種藥味組分(因素)間配伍劑量。根據(jù)析因?qū)嶒灱扒捌陬A(yù)實驗結(jié)果,每個因素設(shè)3個水平值(見表1),選擇L9(34)正交表。以SW620、L02、CIK 3種細胞的增殖抑制率為評價指標(biāo),其檢測方法及計算方法均同上文。為方便后文敘述完成篩選后將方劑命名:蟾五草組分散。

    表1 正交設(shè)計的因素和水平值Tab.1 Orthogonal design’s factors and levels

    1.7 蟾五草組分散對體外細胞存活率的影響 為進一步驗證蟾五草組分散的增效減毒作用,選擇對數(shù)生長期SW620、L02、CIK 3種細胞,按上述方法進行接種至96孔板,培養(yǎng)24 h更換新鮮培養(yǎng)基后分3組(蟾五草組分散組、蟾皮華蟾毒配基組分組、無藥對照組)并設(shè)空白對照組,每組設(shè)3個復(fù)孔。分別于加藥后第1、3、5天取相應(yīng)96孔板進行CCK-8檢測,具體方法同上。按照以下公式計算細胞存活率:

    細胞存活率=(藥物組A值-空白對照組A值)/(無藥對照組A值-空白對照組A值)×100%

    1.8 蟾五草組分散對L02細胞釋放丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響消化對數(shù)生長期L02細胞,臺盼藍計數(shù)后調(diào)整細胞濃度至1×106/mL,以每孔100 μL細胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板,輕輕搖勻并標(biāo)記,置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)24 h后仔細吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,更換新鮮DMEM培養(yǎng)基每孔100 μL,分3組(蟾五草組分散組、蟾皮華蟾毒配基組分組、對照組)并分別加入相應(yīng)藥物(其中蟾皮華蟾毒配基組分劑量為2 μg/mL)。然后補充培養(yǎng)基至總體積每孔200 μL,每組3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)3 d,收集每組3個復(fù)孔的上清液于同一1.5 mL EP 管離心(1 500 r/min,10min),移液器吸取上清液至另一1.5 mL EP管標(biāo)記并送檢。標(biāo)本于檢驗科全自動生化分析儀上檢測ALT和AST的含量。實驗重復(fù)3次。

    1.9 統(tǒng)計分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。析因設(shè)計采用析因設(shè)計方差分析、正交設(shè)計采用直觀分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 4種藥物組分間的交互作用 通過對析因設(shè)計結(jié)果分析,見表2。首先主體效應(yīng)檢驗明確了抑制SW620細胞增殖的主因素是A和C(P<0.01);保護L02和CIK細胞增殖的主因素是B和D(P<0.01);而因素A對3種細胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.01)。其次主體間交互效應(yīng)明確了AD和ABCD對SW620細胞增殖有交互作用(P<0.01);ACD 和ABCD分別對L02和CIK細胞增殖有交互作用(P<0.05)。綜合以上結(jié)果鑒于4種組分配伍(ABCD)經(jīng)交互影響能增強抗腫瘤作用同時降低其毒性,所以藥味選擇時4種組分均被選用,即選取ABCD組方方案。

    2.2 優(yōu)化組分間配伍劑量析因設(shè)計 已分析4種組分間的三階交互作用,此處正交設(shè)計僅比較各組合優(yōu)劣,所以選用較為簡便的直觀分析法進行優(yōu)選配伍劑量。具體實驗結(jié)果見表3、表4。首先比較各單因素不同水平對抑制SW620細胞的影響,可以從表4看出因素A,取A3比取A1和A2的抑制率都高;同理分析因素B、C和D對SW620抑制率最高水平值分別為B2、C2和D3。綜合結(jié)果后組合得出抑制SW620最佳配伍劑量:A3B2C2D3。再比較4個因素的極差值R時,極差越大提示該因素對該細胞株的影響越大。

    其次比較各單因素不同水平對抑制L02和CIK細胞的影響。因本實驗?zāi)康闹皇菫榱私档蚅02和CIK細胞的抑制率,所以應(yīng)選擇低抑制率的劑量。同理用上述分析方法分析表4后得出保護L02和CIK細胞的最優(yōu)配伍劑量分別為:A1B3C3D1和A1B2C1D3。但是本研究以抗腫瘤為主要目的,所以A因素須選擇A3水平才能達到較好抑制腫瘤細胞生長(對SW620抑制率>50%)。因素B在保護L02和CIK方面,B2和B3水平作用相近,但B2對SW620增效更明顯,所以B因素選擇B2。因素C在保護L02和CIK方面,C3和C1水平影響均微弱,但C2對SW620抑制較明顯,所以C因素選擇C2。因素D在保護L02和CIK方面,D1和D3水平均較好,但兩者對L02和CIK作用均不十分明顯,但兩者劑量差距巨大,且在方劑配伍中D為“使”,所以D因素選擇低劑量的D1。綜合以上結(jié)果并組合最優(yōu)配伍劑量,即A3B2C2D1(蟾皮華蟾毒配基組分2 μg/mL,五味子組分 10 μg/mL,黃芪組分 5 μg/mL和甘草酸10 μg/mL,并命名:蟾五草組分散)。

    表2 24析因設(shè)計中各組合對不同細胞增殖抑制率的影響(±s)Tab.2 Results on different cells'survival rate of each combination of Factorial design(24)(±s)%

    表2 24析因設(shè)計中各組合對不同細胞增殖抑制率的影響(±s)Tab.2 Results on different cells'survival rate of each combination of Factorial design(24)(±s)%

    編號 組合 SW620 L02 CIK抑制率 F值 P值 抑制率 F值 P值 抑制率 F值 P值1 A 42.00 2 020.54 0.000 40.33 3 880.72 0.000 50.23 4 140.94 0.000 2 B -0.17 4.314 0.046 -1.21 24.043 0.000 -1.33 10.828 0.002 3 C 6.27 26.551 0.000 2.33 2.111 0.156 1.67 1.663 0.206 4 D -1.87 1.014 0.322 -1.67 19.025 0.000 -1.73 30.504 0.000 5 AB 45.10 0.000 0.983 34.00 0.008 0.927 49.00 0.124 0.727 6 AC 49.20 3.452 0.072 37.47 1.680 0.204 44.33 2.141 0.153 7 AD 48.33 11.560 0.002 33.67 0.263 0.612 44.97 2.008 0.166 8 BC 11.83 0.111 0.741 -2.43 0.016 0.899 -1.73 1.024 0.319 9 BD 1.37 0.544 0.466 -4.53 0.241 0.627 -4.50 1.693 0.202 10 CD 4.73 2.288 0.140 -1.83 1.129 0.296 -2.00 3.446 0.073 11 ABC 46.00 0.030 0.864 36.70 2.258 0.143 44.57 3.277 0.080 12 ABD 49.07 1.992 0.168 32.50 0.307 0.583 37.90 0.889 0.353 13 ACD 47.33 0.507 0.482 38.20 3.328 0.077 42.83 6.564 0.015 14 BCD 4.23 0.227 0.637 -5.10 0.918 0.345 -5.00 1.489 0.231 15 ABCD 55.00 8.232 0.007 34.80 5.101 0.031 42.43 0.341 0.563 16 對照 0 0 0

    表3 正交表L9(34)各因素組合及實驗結(jié)果(±s)Tab.3 Orthogonal design L9(34)’s each combination and its results(±s)

    表3 正交表L9(34)各因素組合及實驗結(jié)果(±s)Tab.3 Orthogonal design L9(34)’s each combination and its results(±s)

    組別 因素組合 細胞增殖抑制率(%)SW620 L02 CIK 1 A1B1C1D1 5.67 9.90 14.93 2 A1B2C3D3 8.73 8.30 9.69 3 A1B3C2D2 9.07 6.50 11.93 4 A2B3C3D1 30.83 29.00 42.97 5 A2B2C1D2 30.26 32.47 37.33 6 A2B1C2D3 33.20 33.80 42.20 7 A3B3C1D3 55.77 34.77 41.50 8 A3B2C2D1 59.45 36.63 45.17 9 A3B1C3D2 56.40 39.40 47.07

    2.3 蟾五草組分散對體外細胞存活的影響 與蟾皮華蟾毒配基組分相比,高效低毒的蟾五草組分散對蟾皮華蟾毒配基組分抑制SW620的增效作用集中在第5天(P<0.01);而蟾五草組分散降低蟾皮華蟾毒配基組分對L02、CIK的毒性集中體現(xiàn)在第3天(P<0.05),隨著時間延長保護作用減弱,見表5。

    表4 直觀分析的結(jié)果Tab.4 Direct-viewing analysis’results

    2.4 蟾五草組分散對L02細胞釋放ALT、AST的影響 蟾皮華蟾毒配基組分與對照組比較有明顯升高 ALT、AST 的作用(P<0.05),見表 6。蟾五草組分散的L02細胞釋放ALT相對蟾皮華蟾毒配基組分有明顯下降(P<0.05),但AST只有下降趨勢(P>0.05)。說明蟾五草組分散對其蟾皮華蟾毒配基組分造成的L02細胞損傷有一定保護作用。

    表5 3種細胞不同時間點細胞存活率(±s)Tab.5 Survival rate of three kinds cell lines in different time(±s)%

    表5 3種細胞不同時間點細胞存活率(±s)Tab.5 Survival rate of three kinds cell lines in different time(±s)%

    注:與蟾皮華蟾毒配基組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別 SW620 L02 CIK第1天 第3天 第5天 第1天 第3天 第5天 第1天 第3天 第5天蟾五草組分散 74.50±3.25 42.53±3.66 17.97±2.78** 86.03±2.13 64.20±3.32* 22.77±2.55 80.90±3.75 56.03±4.00* 33.20±2.55蟾皮華蟾毒配基組分 79.73±3.12 47.63±4.24 29.20±2.57 82.30±3.22 57.16±2.00 20.30±3.25 77.30±3.63 46.97±3.15 28.43±1.94

    表6 蟾五草組分散對L02細胞釋放ALT、AST的影響(±s)Tab.6 Effect of L02 cell releasing the ALT and AST with CFP(±s)U/L

    表6 蟾五草組分散對L02細胞釋放ALT、AST的影響(±s)Tab.6 Effect of L02 cell releasing the ALT and AST with CFP(±s)U/L

    注:與對照組比較,*P<0.05;與蟾五草組分散組比較,#P<0.05。

    組別 ALT AST蟾五草組分散 2.16±0.15 3.83±0.25蟾皮華蟾毒配基組分 2.63±0.25*# 4.43±0.40*對照組 2.03±0.21 3.43±0.25

    3 討論

    中藥配伍理論是中藥方劑最寶貴的方藥理論,通過配伍來改變原藥物藥效而實現(xiàn)增效減毒[8-9]。通過前期實驗已明確蟾皮華蟾毒配基組分具有較強抗腫瘤作用,所以是本實驗的君藥[1]。選用五味子、黃芪、甘草的有效組分與之配伍以期降低其毒副作用,從而達到祛邪不傷正的目的。

    利用析因?qū)嶒灧治隽怂幬镏g的主體效應(yīng)和交互效應(yīng),明確藥味在組方中的必要性。主體效應(yīng)提示蟾皮華蟾毒配基組分(A)、五味子組分(B)和甘草酸(D)的作用最為突出,但交互效應(yīng)提示蟾皮華蟾毒配基組分(A)與五味子組分(B)、黃芪組分(C)和甘草酸(D)有交互影響,而且4種藥物(ABCD)共同配伍時交互影響有顯著意義。文獻也報道黃芪和甘草合用能提高機體抗應(yīng)激能力[10],而五味子和甘草合用能提高肝藥酶的代謝[11],說明它們之間同本實驗一樣存在交互作用。藥物組方時4種組分均被選用以增效減毒,并為下一步實驗確定了藥味組成。

    通過正交實驗設(shè)計來優(yōu)選4種藥味不同劑量水平下的配伍劑量。為合理控制實驗規(guī)模,各藥味(因素)設(shè)3個水平。結(jié)果提示抑制SW620最優(yōu)配伍劑量:A3B2C2D3,而保護L02和CIK細胞的最優(yōu)配伍劑量分別為:A1B3C3D1和A1B2C1D3。陳云華等[12]發(fā)現(xiàn)甘草酸對肝細胞的體外最大保護效能33%,不成量效關(guān)系。孫華麗等[13]發(fā)現(xiàn)五味子成分在25 μg/mL時可以顯著降低肝細胞轉(zhuǎn)氨酶。各因素對不同細胞的作用劑量呈不同效應(yīng),符合文獻提示的不成量效關(guān)系。本實驗以抗腫瘤為主要目的,所以A為君藥并選擇A3水平。另外,相似療效下以低劑量水平更符合用藥原則,所以B因素選擇B2水平,C因素選擇C2水平,D因素選擇D1水平。綜合各結(jié)果最終確定優(yōu)化配伍劑量為:A3B2C2D1,并命名:蟾五草組分散。然而正交實驗是部分水平的組合,且水平數(shù)有限又為體外實驗,不能全面分析所有組合,可能還有更優(yōu)配伍需后續(xù)深入挖掘。

    蟾五草組分散對L02和CIK細胞存活率僅在一定時間范圍內(nèi)可以起到保護作用。在第3天時效果最明顯,隨后保護作用下降,這可能與細胞代謝障礙有關(guān)。在體外實驗條件下,藥物之間的多重作用下可能細胞功能難以得到連動并長期維持。也可能與細胞長期處于蟾皮華蟾毒配基組分毒性環(huán)境下細胞代謝減弱,而其他藥物保護作用逐漸失去效應(yīng)有關(guān)。從L02細胞釋放ALT、AST濃度變化中,發(fā)現(xiàn)蟾五草組分散有保護L02細胞的作用。有文獻報道甘草酸降低轉(zhuǎn)氨酶在小鼠體內(nèi)顯著[14-15],而五味子在16.7 μg/mL濃度下可以降低肝細胞轉(zhuǎn)氨酶[13]。由于復(fù)方的藥代動力學(xué)相對單藥代謝更為復(fù)雜,也許在小鼠體內(nèi)更能體現(xiàn)出降低轉(zhuǎn)氨酶作用。

    通過本實驗確定了蟾五草組分散的組成和配伍劑量,初步得到了高效低毒的復(fù)方組分群,為進一步觀察在小鼠體內(nèi)藥效實驗奠定了基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    配基抑制率組分
    中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    組分分發(fā)管理系統(tǒng)在天然氣計量的應(yīng)用
    血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    一種難溶難熔未知組分板材的定性分析
    色胺混合模式層析介質(zhì)制備及配基密度影響研究*
    黑順片不同組分對正常小鼠的急性毒性
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:26
    金雀花中黃酮苷類組分鑒定及2種成分測定
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:09
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    親和仿生層析及在抗體純化中的應(yīng)用
    接枝聚合物配基的蛋白質(zhì)吸附層析
    毛片女人毛片| 日本黄大片高清| 女人久久www免费人成看片| 看十八女毛片水多多多| 男的添女的下面高潮视频| 中文欧美无线码| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲自拍偷在线| 日本与韩国留学比较| 国产精品.久久久| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 日本熟妇午夜| 国产有黄有色有爽视频| 尾随美女入室| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 18禁动态无遮挡网站| 精品久久久久久久久久久久久| 男女那种视频在线观看| 国产亚洲精品av在线| 特级一级黄色大片| 免费观看a级毛片全部| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 秋霞伦理黄片| 亚洲av中文av极速乱| 夫妻午夜视频| 久久精品国产亚洲网站| 尾随美女入室| eeuss影院久久| 观看美女的网站| 青春草国产在线视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 永久免费av网站大全| 男女下面进入的视频免费午夜| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99热全是精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 久久久久精品性色| 欧美高清成人免费视频www| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美精品国产亚洲| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品一二三| 亚洲av中文av极速乱| 男女国产视频网站| 国产精品熟女久久久久浪| av在线老鸭窝| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| av卡一久久| 99久国产av精品| 亚洲无线观看免费| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日本黄色片子视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜老司机福利剧场| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲经典国产精华液单| 美女黄网站色视频| 成年人午夜在线观看视频 | 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品国产成人久久av| 99热6这里只有精品| 少妇的逼水好多| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲国产精品国产精品| 国产免费一级a男人的天堂| xxx大片免费视频| 国产淫片久久久久久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 嫩草影院入口| 欧美97在线视频| 国产免费一级a男人的天堂| 九色成人免费人妻av| 最近2019中文字幕mv第一页| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲精品日本国产第一区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品精品国产色婷婷| 久久精品久久久久久久性| 欧美人与善性xxx| 日本色播在线视频| 日韩欧美精品免费久久| av专区在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲最大成人av| 麻豆乱淫一区二区| 少妇高潮的动态图| 一级毛片 在线播放| 在现免费观看毛片| 欧美日本视频| 欧美日韩精品成人综合77777| av卡一久久| 丝袜喷水一区| 国产黄色免费在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产精品一二三区在线看| 欧美激情国产日韩精品一区| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久色成人| 人妻一区二区av| 91av网一区二区| av卡一久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲欧洲日产国产| 嘟嘟电影网在线观看| 色综合色国产| 九色成人免费人妻av| 免费在线观看成人毛片| 国产大屁股一区二区在线视频| 精品一区二区三卡| 可以在线观看毛片的网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品不卡视频一区二区| av天堂中文字幕网| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚州av有码| 舔av片在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 黑人高潮一二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 深爱激情五月婷婷| 乱系列少妇在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一级毛片aaaaaa免费看小| .国产精品久久| av在线亚洲专区| 成人亚洲精品一区在线观看 | 99久国产av精品| 丝瓜视频免费看黄片| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲性久久影院| 一个人看的www免费观看视频| 国产成人freesex在线| 国产av码专区亚洲av| 精品不卡国产一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久久精品久久久久真实原创| 色哟哟·www| 好男人视频免费观看在线| a级毛色黄片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产欧美在线一区| 美女内射精品一级片tv| 三级毛片av免费| 亚洲精品国产av蜜桃| 丝袜喷水一区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲精品色激情综合| 69av精品久久久久久| 干丝袜人妻中文字幕| 日韩电影二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 草草在线视频免费看| 国产精品日韩av在线免费观看| 插阴视频在线观看视频| 国产精品蜜桃在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 一级毛片我不卡| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日日啪夜夜撸| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 韩国高清视频一区二区三区| 在线播放无遮挡| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲av一区综合| av免费观看日本| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 黄色一级大片看看| 亚洲av男天堂| 国产精品一区www在线观看| 免费看不卡的av| 国产真实伦视频高清在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 一级黄片播放器| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲av二区三区四区| 99久久中文字幕三级久久日本| 丰满少妇做爰视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 老司机影院毛片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 成人国产麻豆网| 午夜亚洲福利在线播放| 又爽又黄无遮挡网站| 91狼人影院| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲国产欧美人成| 乱系列少妇在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩欧美三级三区| 国产亚洲精品久久久com| videos熟女内射| 免费观看av网站的网址| 精品午夜福利在线看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产免费又黄又爽又色| 色综合亚洲欧美另类图片| 最近的中文字幕免费完整| 久久久久久久久久久免费av| 中国国产av一级| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 床上黄色一级片| 18禁动态无遮挡网站| 一区二区三区高清视频在线| 午夜福利视频1000在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 久久久久久久久久黄片| 91在线精品国自产拍蜜月| 22中文网久久字幕| av网站免费在线观看视频 | 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲av免费在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 国产成人a区在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 国产亚洲91精品色在线| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲三级黄色毛片| 男的添女的下面高潮视频| 搡老乐熟女国产| 美女高潮的动态| 色综合色国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 2021少妇久久久久久久久久久| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国产一区二区三区av在线| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久国产网址| 久久久久久久午夜电影| 黄色欧美视频在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 久久草成人影院| 久久久亚洲精品成人影院| 久久午夜福利片| 特级一级黄色大片| 欧美性感艳星| 少妇的逼水好多| 国产成年人精品一区二区| 免费黄网站久久成人精品| 免费看a级黄色片| 亚洲国产色片| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久av不卡| 国产毛片a区久久久久| 亚洲最大成人av| 精品一区二区三卡| 国产精品一区二区三区四区久久| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 天堂网av新在线| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 极品教师在线视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 天堂俺去俺来也www色官网 | 男人爽女人下面视频在线观看| av福利片在线观看| 色播亚洲综合网| 黑人高潮一二区| 国产精品一二三区在线看| 两个人的视频大全免费| 国产av国产精品国产| 日韩欧美国产在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日本-黄色视频高清免费观看| av免费在线看不卡| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久a久久爽久久v久久| 永久网站在线| 九色成人免费人妻av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 超碰av人人做人人爽久久| 国产69精品久久久久777片| 国产伦一二天堂av在线观看| 免费观看a级毛片全部| 成人午夜高清在线视频| 欧美潮喷喷水| 永久网站在线| 91av网一区二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 麻豆成人av视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久久a久久爽久久v久久| 男女啪啪激烈高潮av片| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久久久久久久丰满| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产免费一级a男人的天堂| 国产成人91sexporn| 一夜夜www| 成人av在线播放网站| 成年av动漫网址| 国产精品一区二区在线观看99 | 九色成人免费人妻av| 人妻系列 视频| 岛国毛片在线播放| 久久久成人免费电影| 成年人午夜在线观看视频 | 国产成人精品一,二区| 久久久久久久久久久免费av| 免费电影在线观看免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 青春草视频在线免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品国产成人久久av| 韩国av在线不卡| 18+在线观看网站| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产高清有码在线观看视频| 直男gayav资源| 色网站视频免费| 日韩三级伦理在线观看| 能在线免费观看的黄片| 人妻一区二区av| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久国内精品自在自线图片| 精品一区二区三卡| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产成人a∨麻豆精品| 午夜久久久久精精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 51国产日韩欧美| 老司机影院毛片| 久久97久久精品| 免费看不卡的av| 亚洲av免费在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 色吧在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲在线自拍视频| 一边亲一边摸免费视频| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲精品国产成人久久av| 少妇的逼水好多| 91久久精品国产一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 精品久久久久久久久av| kizo精华| 一个人免费在线观看电影| 欧美+日韩+精品| 国产黄色小视频在线观看| 免费看光身美女| 最近中文字幕高清免费大全6| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 内射极品少妇av片p| 综合色丁香网| 久久久久久久久久久免费av| 一本久久精品| 欧美精品一区二区大全| 午夜激情欧美在线| 深夜a级毛片| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 高清毛片免费看| 亚洲伊人久久精品综合| 免费少妇av软件| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲精品一二三| 一级毛片久久久久久久久女| 内射极品少妇av片p| 国产av国产精品国产| 三级经典国产精品| 免费观看的影片在线观看| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲精品第二区| 国产av在哪里看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | a级毛色黄片| 国产乱来视频区| 男女那种视频在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 观看美女的网站| 中文在线观看免费www的网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 九九在线视频观看精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| 好男人视频免费观看在线| 高清视频免费观看一区二区 | 亚洲av成人精品一区久久| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日本-黄色视频高清免费观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品久久久久久成人av| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜激情欧美在线| 国产精品一区二区性色av| 有码 亚洲区| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av.av天堂| 国产黄色视频一区二区在线观看| 尾随美女入室| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 色视频www国产| 日本熟妇午夜| 免费电影在线观看免费观看| 午夜激情欧美在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 99热这里只有精品一区| av免费在线看不卡| 欧美潮喷喷水| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产高清不卡午夜福利| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜久久久久精精品| 高清av免费在线| 欧美日本视频| 大片免费播放器 马上看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产熟女欧美一区二区| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美日韩在线观看h| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品一及| 日韩一区二区视频免费看| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久久久九九精品二区国产| 日韩一区二区三区影片| 亚洲国产av新网站| 秋霞伦理黄片| 成人午夜高清在线视频| 日本黄大片高清| a级毛色黄片| 精品国产三级普通话版| 夜夜爽夜夜爽视频| 观看美女的网站| 国产老妇女一区| 日本免费在线观看一区| 好男人在线观看高清免费视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产91av在线免费观看| 亚洲自偷自拍三级| 国产伦在线观看视频一区| 六月丁香七月| 亚洲精品aⅴ在线观看| a级毛色黄片| 草草在线视频免费看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲av二区三区四区| av女优亚洲男人天堂| 久久久午夜欧美精品| 99热这里只有精品一区| 精品久久久久久久久av| www.av在线官网国产| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品无大码| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲18禁久久av| 国产色婷婷99| 国产亚洲91精品色在线| 老女人水多毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 国产视频内射| 亚洲精品,欧美精品| 人妻少妇偷人精品九色| 大话2 男鬼变身卡| 久久国内精品自在自线图片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国精品久久久久久国模美| .国产精品久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 天堂影院成人在线观看| 国产毛片a区久久久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 午夜免费观看性视频| 2018国产大陆天天弄谢| 可以在线观看毛片的网站| 国产成人免费观看mmmm| 老女人水多毛片| 亚洲av福利一区| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产成人精品婷婷| 可以在线观看毛片的网站| 2018国产大陆天天弄谢| 免费人成在线观看视频色| 亚州av有码| 天堂网av新在线| 日本色播在线视频| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩av不卡免费在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲av中文av极速乱| 色视频www国产| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品一区www在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲高清免费不卡视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | av国产久精品久网站免费入址| 在线a可以看的网站| 插阴视频在线观看视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品欧美国产一区二区三| av网站免费在线观看视频 | 国产探花极品一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 精品酒店卫生间| videossex国产| 国产免费福利视频在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品国产三级专区第一集| 成年免费大片在线观看| 美女国产视频在线观看| 国产午夜精品论理片| 99久国产av精品国产电影| 日本色播在线视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久久久亚洲中文字幕| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产高潮美女av| 久久精品国产亚洲av天美| or卡值多少钱| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品久久久久久久久免| 有码 亚洲区| 国产男女超爽视频在线观看| 成年免费大片在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久久久久久久久久免费av| 人妻系列 视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久久久久久久成人| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 黄色一级大片看看| 最近2019中文字幕mv第一页| 高清日韩中文字幕在线| 伊人久久精品亚洲午夜| av女优亚洲男人天堂| 久久99热这里只有精品18| 国产午夜精品论理片| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品av视频在线免费观看| 免费看不卡的av| 91久久精品国产一区二区成人| 在线a可以看的网站| 日本wwww免费看| 麻豆乱淫一区二区| 少妇丰满av| 免费人成在线观看视频色| 国产黄色小视频在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 午夜福利成人在线免费观看| 我的女老师完整版在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲色图av天堂| 老司机影院成人| freevideosex欧美| 亚洲人成网站在线播| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一夜夜www| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 亚洲国产色片| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲精品国产av蜜桃| 在线免费观看的www视频| 国产在线男女|