HPLC梯度洗脫測(cè)定黃芪葉中鼠李檸檬素葡萄糖苷的含量

【摘 要】 目的：建立HPLC梯度洗脫測(cè)定黃芪葉中量大成分鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量。方法：HPLC法；色譜柱：Diamonsil-C18（5?m， 4.6nm×250nm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～45min， 10%A→85%A），流速1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)266.9nm，柱溫25℃。結(jié)果：鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷在2.1～33.0?g范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r = 0.9999），平均加樣回收率（n=9）99.3%，RSD=1.35%；6批黃芪葉中鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷平均含量為0.44%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，為黃芪葉質(zhì)量控制提供了科學(xué)的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 黃芪葉；含量測(cè)定

黃芪葉具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗病毒、能有效的保護(hù)肝臟，降血糖等作用[1]。葉中主要含黃酮和皂苷類(lèi)成分[2]。本文建立了黃芪葉中鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷含量測(cè)定方法，并比較6個(gè)批次黃芪葉鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量，為評(píng)價(jià)黃芪葉的質(zhì)量控制和綜合開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑

1.1儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，四元梯度泵，2996型PDA檢測(cè)器；梅特勒AL204天平（Mettler-Toledo Group）；梅特勒AB265-S天平（Mettler-Toledo Group）。

1.2試藥

鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷由實(shí)驗(yàn)室自制，結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、IR和NMR確證，HPLC （峰面積歸一化法）純度>98.5%；甲醇（色譜純，Dikma公司）；水為超純水；其余試劑為分析純。

黃芪葉于2010年采集于黑龍江省大興安嶺，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為膜莢黃芪的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取對(duì)照品鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷4.13mg置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并加至刻度，搖勻，配制成0.413mg/mL鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的對(duì)照品液。

2.2 供試品溶液的制備

取黃芪葉，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，精密稱(chēng)取約2.0g，置圓底燒瓶中，精密加甲醇50mL，稱(chēng)定重量，加熱回流4個(gè)小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，甲醇補(bǔ)足減少的重量，混勻，濾過(guò)，精密取續(xù)濾液25ml，收干溶劑，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即為供試品。

2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18（5?m， 4.6nm×250nm）；流動(dòng)相：甲醇（A） -水（B），梯度洗脫（0～45min， 10%A→85%A），流速1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)266.9nm，柱溫25℃。理論塔板數(shù)按鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷計(jì)算，不低于6000。對(duì)照品與樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5、10、20、40、80?L，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸，獲得回歸方程Y=3000000X-750318，r=0.9999，表明鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷在2.1～33.0?g時(shí)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度

精密吸取對(duì)照品10μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷RSD=0.98%。說(shuō)明精密度高。

2.6 重復(fù)性

精密稱(chēng)取同一批次供試品黃芪葉約2.0g共6份，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10μL，測(cè)定。記錄峰面積，結(jié)果鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷含量的平均值為4.39mg/g，RSD=1.3%。說(shuō)明此方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，室溫放置0，2，4，12，18，24 h后，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，結(jié)果RSD（n=6）為1.12%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，置5ml容量瓶中，配成濃度為2.21mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密稱(chēng)取同一批次的黃芪葉樣品約0.5g，共9份，根據(jù)樣品中含鼠李檸檬素3-O-β-D-葡萄糖苷量的50%，100%，150%，分別向樣品中加入2.21mg/ml對(duì)照品液0.5，1.0，1.5mL，各3份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率平均值為99.3%（n=9），RSD為1.35%。

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取6個(gè)批次的黃芪葉，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，各3份，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量10?L，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃賢榮， 梁愛(ài)君， 黃忠， 等. 黃芪莖葉藥理作用研究進(jìn)展[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 28（3）：264-270.

[2] 陳虎虎， 龔蘇曉， 張鐵軍， 等. 黃芪莖、葉的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)評(píng)價(jià)研究， 2011， 34（2）：134-137.

通訊作者：馬振平， 女（漢族）， 碩士，藥師