超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中 5種β—受體激動劑殘留

代立勤 崔銀倉

摘要 建立了豬肉樣中5種β-受體激動劑克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林和西馬特羅的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣品量取后，加入乙酸鈉水溶液，采用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解處理（37 ℃），過濾后，用MCX固相萃取柱凈化，采用UPLC-MS/MS 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。5種β-受體激動劑的檢出限均為0.125 μg/kg，定量下限為0.25 μg/kg，在0.25、0.5、1.0 μg/kg 3個濃度添加水平，總體平均回收率為83.3%～115.0%，總體相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)。本方法分析速度快，靈敏度高，重現(xiàn)性好，各項技術(shù)指標(biāo)均滿足國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)要求，可用于各種動物源性樣品中5種β-受體激動劑殘留的快速檢測。

關(guān)鍵詞 受體激動劑；豬肉；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號 TS251.7 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）13-0253-02

受體激動劑亦稱完全激動劑（full agonist），對受體有較強親和力和內(nèi)在活性，能通過受體興奮發(fā)揮最大效應(yīng)。β-受體激動劑，俗稱瘦肉精，是一類化學(xué)合成的結(jié)構(gòu)和功能類似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，包括非選擇性β-受體激動劑如異丙腎上腺素，選擇性心臟β1-受體激動劑如多巴酚丁胺，選擇性β2-受體激動劑如沙丁胺醇、叔丁、喘寧等。β2-受體激動劑可興奮氣道平滑肌和肥大細胞膜表面的β2-受體，其通過舒張氣道平滑肌、減少肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒及其介質(zhì)的釋放、降低微血管的通透性、增加氣道上皮纖毛的擺動等途徑緩解哮喘癥狀。我國農(nóng)業(yè)部1997年發(fā)文禁止瘦豬肉精在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用，商務(wù)部自2009年12月9日起禁止進出口萊克多巴胺和鹽酸萊克多巴胺 。2001年12月27日及2002年2月9日、4月9日，農(nóng)業(yè)部分別下文禁止使用β-激動劑類藥物作為飼料添加劑（農(nóng)業(yè)部176號公告、193號公告、1519號條例）。β-受體激動劑具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核，為苯乙醇胺類物質(zhì)。按照苯環(huán)上取代基的不同，可分為苯胺型和苯酚型，而苯酚型β-受體激動劑又分為鄰苯二酚型、間苯二酚型及水楊醇型。目前，檢測β-受體激動劑的方法主要有高效液相色譜法[1]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[2-4]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[5-10]及酶聯(lián)免疫法[11-12]等。本文主要對豬肉樣中的克倫特羅（Cl-enbuterol）、萊克多巴胺（Ractopamine）、沙丁胺醇（Salbut-amol）、西馬特羅（Cimaterol）和特布他林（Tulobuterol）進行了針對性的研究。β-受體激動劑的母核結(jié)構(gòu)及此次研究的幾種化合物有以下種類。①苯酚型：沙丁胺醇，取代基位置為R1（CH2OH）、R2（OH）、R3（H）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）；萊克多巴胺，取代基位置為R1（H）、R2（OH）、R3（H）、R4（H）、R5（H）、R6（CH2-CH2-P-OH）；特布他林，取代基位置為R1（OH）、R2（H）、R3（OH）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）。②苯胺型：克倫特羅，取代基位置為R1（Cl）、R2（NH2）、R3（Cl）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）；西馬特羅，取代基位置為R1（H）、R2（NH2）、R3（N）、R4（H）、R5（CH3）、R6（H）。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC H-Class（美國Waters公司）；Xevo TQD質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；高速勻漿機（德國IKA）。

甲醇、乙腈、甲酸均為進口色譜純；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（德國Merck公司）；試驗用水為屈臣氏蒸餾水。

標(biāo)準(zhǔn)品：特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克倫特羅，純度均≥98.0%；克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、特布他林-D9、西馬特羅-D7，純度均 ≥92.0%。

SPE小柱：MCX固相萃取柱（6 mL，500 mg），購自上海安譜公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)（外標(biāo)）儲備液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取適量的特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅對照品，用甲醇分別配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于0～5 ℃冰箱中保存，有效期為3個月。標(biāo)準(zhǔn)（內(nèi)標(biāo)）儲備液：克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、特布他林-D9、西馬特羅-D7對照品，用甲醇分別配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，0～5 ℃冰箱中保存，有效期為3個月。中間使用液：使用時用甲醇配制成100 ng/mL的混標(biāo)溶液。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：選取空白豬肉樣，與樣品前處理步驟同步進行處理，最后用1.0 mL 0.1%甲酸溶液溶解，制成濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)濃度均為20 ng/mL。

1.3 樣品處理與凈化

1.3.1 酶解。準(zhǔn)確量取2.0 g試樣，置于50 mL具螺旋蓋的聚丙烯離心管中，添加20 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液，加入10 mL乙酸鈉緩沖溶液（pH =5.2），然后加入50 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，充分振蕩混勻，37 ℃避光恒溫震蕩酶解16 h。

1.3.2 提取。酶解后放置至室溫，并渦旋混勻，在5 ℃條件下10 000 r/min高速離心5 min，收集上清液于50 mL離心管內(nèi)，加入5 mL正己烷，渦旋混勻。5 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，棄去正己烷層。再向離心管中加入5 mL正己烷，渦旋混勻，5 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，棄去正己烷層，將離心管中的水相溶液立即經(jīng)濾紙或者脫脂棉過濾，并用 5 mL乙酸鈉緩沖溶液洗滌濾紙，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至9.5±0.2，待凈化。

1.3.3 凈化。將所得濾液全部加載在固相萃取柱（MCX）上，再依次用6 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、6 mL水、6 mL 50%甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液；負壓下抽干2 min，用5 mL洗脫液（甲醇∶氨水=95∶5）進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50 ℃下氮吹吹干，加入1 mL 0.1%甲酸溶液溶解殘渣，樣液過0.2 μm濾膜后直接上機。

1.3.4 結(jié)果計算。內(nèi)標(biāo)法定量。

1.4 LC-MS/MS 條件

1.4.1 色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC？誖 BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），Part No：186002350；流動相及梯度洗脫條件：流動相為0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液，以總體積為100%計算，流動相速度為0.25 mL/min；0～6.5 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由20%變化至90%，6.5～7.5 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由90%變化至25%，7.5～9.0 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由25%變化至67%，0～10 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由67%變化至20%，10～12 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例不變。

1.4.2 質(zhì)譜條件。電噴霧電壓：3.00 kV，離子源溫度：110 ℃；色譜柱溫度：30 ℃；洗脫溶劑溫度：350 ℃；氣體流量（N2）：650 L/h；錐孔氣流量（N2）：50 L/h；流動相流速：0.250 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

動物性肉樣成分組成復(fù)雜，含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)等，如果前處理過程的提取、凈化中殘留過多的樣品基質(zhì)，將會影響到分析檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。因為樣品基質(zhì)對離子電離有抑制作用，不同的基質(zhì)往往造成的基質(zhì)效應(yīng)也不同。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，在空白樣品中添加本次試驗研究的5種β-受體激動劑和對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)進行前處理，可使標(biāo)樣和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品的基質(zhì)效應(yīng)，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。

通過使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行調(diào)諧，不斷優(yōu)化儀器條件，使每種物質(zhì)的響應(yīng)值達到要求的最低范圍，最終保證定性、定量、準(zhǔn)確。表1為最終得到的質(zhì)譜條件各項數(shù)值。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和加標(biāo)回收率

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0.5～50.0 ng/mL范圍內(nèi)，采用同位素內(nèi)標(biāo)法，分別以定量離子峰面積比值（定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度比值（化合物質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度之比）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取空白樣品進行加標(biāo)回收率測定，選取0.25、0.5、1.0 μg/kg 3個濃度添加水平為最終測定濃度進行空白樣品添加，5種受體激動劑的回收率范圍為83.3%～115.0%（表2）。

2.3 方法檢出限定量限

方法檢出限按S/N=3 計算，5 種β-受體激動劑檢出限都可以達到0.125 μg/kg；定量限按照S/N=10 計算，5種β-受體激動劑檢測限都可以達到0.25 μg/kg，方法檢出限和定量限均滿足目前5種β-受體激動劑最大限量值檢測要求。

3 結(jié)論

本文建立了豬肉樣中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林和西馬特羅5種藥物同時分析的LC-MS/MS 分析方法。該方法具有簡單、準(zhǔn)確和靈敏的特點，能夠滿足藥物殘留分析要求，此方法也可被推廣應(yīng)用到其他動物性產(chǎn)品的受體激動劑檢測中。

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