地下芽孢桿菌ZDC—01抑菌效果及其防效研究

邱森森 胡修俊 朱鳳蒙 張德超

摘要 對(duì)從東海海底土壤沉積物中分離獲得的菌株ZDC-01的抑菌活性、抑菌機(jī)理、室內(nèi)防治效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該菌株對(duì)8種病原菌具有顯著的抑菌作用，菌懸液較無菌濾液的抑制率更高，抑制率高達(dá)96.87%。通過噴霧處理刺傷接種發(fā)現(xiàn)，噴施ZDC-01發(fā)酵液、菌懸液的防治效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)稍有降低，但仍與腐霉利處理相當(dāng)，而無菌濾液的防治效果較差，7 d后僅為9.53%。

關(guān)鍵詞 菌株ZDC-01；抑菌活性；抑菌機(jī)理；防治效果

中圖分類號(hào) S476+.19 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）13-0097-02

Research on Antibacterial Effect and Control Efficiency of Bacillus subterraneus ZDC-01

QIU Sen-sen 1 HU Xiu-jun 1 ZHU Feng-meng 1 ZHANG De-chao 2

（1 Qingdao Zhongda Agritech Co.，Ltd.，Qingdao Shandong 266109； 2 Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences）

Abstract The antimicrobial activity，antimicrobial mechanism and control effect of strain ZDC-01 isolated from the soil sediments of the seabed in the east China sea were studied.The results showed that the strain had significant inhibitory effect on 8 fungi，the inhibition rate of bacterial suspension was better than that of sterile filtrate，and the inhibition rate was 96.87%.By inoculation of spray-treated stab wound it was found that the control effects of fermentation broth and bacteria suspension decreased slightly with the prolongation of time，but were still equal to that of procymidone.The control effect of sterile filtrate was only 9.53% after 7 days.

Key words strain ZDC-01；antimicrobial activity；antimicrobial mechanism；control effect

植物病害是影響植物健康、作物產(chǎn)量甚至生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素，更是作物生產(chǎn)中不可忽視的一大難題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因植物病害造成的減產(chǎn)損失為總產(chǎn)量的10%～15%，其中70%～80%是由病原真菌侵染所致[1-2]。植物真菌病害不僅直接造成農(nóng)作物產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低，而且部分病原真菌還分泌多種毒素，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全造成極大的威脅。此外，目前植物真菌病害的防治以化學(xué)防治為主，但化學(xué)藥劑易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、抗藥性等一系列問題，甚至?xí)：θ诵蠼】?。生物防治具有安全環(huán)保、持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，其發(fā)展趨勢(shì)與食品安全、生態(tài)環(huán)境和生物多樣性有良好的相融性[3]。因此，尋找廣譜、高效的生物農(nóng)藥成為農(nóng)藥發(fā)展的新方向。

隨著生物防治研究的不斷深入，從陸生資源中分離篩選出新的有效生防菌越來越難，探索新的生防資源迫在眉睫。海洋微生物因其遺傳和代謝的特殊性而具有產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)的巨大潛力[4-7]，目前已有關(guān)于海洋生防微生物的報(bào)道。邵彥坡等[8]發(fā)現(xiàn)了1株海洋放線菌B5對(duì)13種植物真菌病害有顯著的抑制作用，并對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行了穩(wěn)定性測(cè)定；田 黎等[9]報(bào)道1株海洋芽孢桿菌B-9987的代謝產(chǎn)物不僅可以破壞真菌病害的菌絲，還可促進(jìn)植物生長(zhǎng)；陳 香等[10]鑒定了1株海洋短小枯草芽孢桿菌，并對(duì)其生長(zhǎng)條件和抑菌活性進(jìn)行了研究。本研究從東海海底土壤沉積物（北緯31°00′，東經(jīng)124°3′）中分離篩選出1株具有抑菌活性的海洋細(xì)菌，在鑒定的基礎(chǔ)上對(duì)該菌株的抑菌活性、抑菌機(jī)理以及室內(nèi)防治效果進(jìn)行了初步研究，以期為進(jìn)一步研究該菌及其對(duì)植物病害的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株。菌株ZDC-01，由中國科學(xué)院海洋研究所從東海海底土壤沉積物中分離獲得，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA序列分析，將其鑒定為地下芽孢桿菌Bacillus subterraneus。供試病原真菌有蘋果葉枯炭疽病菌（Glomerella cingulate）、茄子灰霉病菌（Botrytis cinerea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、柑橘炭疽病菌[Coll-etotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc]、蘋果炭疽病菌（Glom-erella cingulata）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea），由青島中達(dá)生物技術(shù)研究所生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。2216E培養(yǎng)基（酵母提取物1 g，蛋白胨5 g，瓊脂粉20 g，過濾后的海水1 000 mL，pH調(diào)至7.4～7.5），用于海洋細(xì)菌菌株的活化與保存；LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.0～7.2），用于菌株ZDC-01的發(fā)酵培養(yǎng)和抑菌機(jī)理研究；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.0～7.2），用于植物病原真菌的活化與保存。

1.1.3 供試藥劑。50%腐霉利可濕性粉劑，由日本住友化學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株ZDC-01抑菌活性測(cè)定。采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[11]，在直徑90 mm的LB平板一側(cè)接種病原菌菌餅，在平板另一側(cè)劃線接種菌株ZDC-01，兩者相距25 mm，以單獨(dú)接種病原菌的平板作對(duì)照。于25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，4 d后測(cè)量抑菌帶寬度，每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 菌株ZDC-01抑菌機(jī)理。用接種環(huán)挑取菌株ZDC-01的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，得到菌株ZDC-01種子液。按2%的初始接種量接種于98 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，即為ZDC-01發(fā)酵液。將發(fā)酵液于7 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，經(jīng)細(xì)菌過濾器（孔徑0.22 μm）過濾即得無菌濾液。將發(fā)酵液在7 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，收集菌體，用無菌水洗滌菌體，并用其制成菌懸液。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]，將無菌濾液和菌懸液分別與融化冷卻的LB培養(yǎng)基（45～50 ℃）混勻（稀釋50倍），倒平板，于平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，以單獨(dú)接種病原菌的平板作對(duì)照。于25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，待對(duì)照長(zhǎng)滿3/4培養(yǎng)皿時(shí)，用十字交叉法測(cè)量對(duì)照組及處理組的菌落直徑，計(jì)算抑制率，每處理設(shè)3次重復(fù)。計(jì)算公式如下：

抑制率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）×100

1.2.3 菌株ZDC-01對(duì)茄子灰霉病的防治效果。采用噴霧處理刺傷接種法[13]，選擇長(zhǎng)度240～300 mm的健康茄子，經(jīng)流水洗凈后用75%酒精表面消毒，晾干備用。在果實(shí)1/3、2/3處刺傷（傷口直徑約0.3 mm，深約1.0 mm），每個(gè)果實(shí)4處傷口。將上述處理液均勻噴霧到果實(shí)上直到有水滴滴下，在無菌操作臺(tái)上吹干后再次噴霧，直至每個(gè)果實(shí)接種15 mL處理液，于24 h后在刺傷處接種茄子灰霉病菌菌餅；對(duì)照組和農(nóng)藥處理組果實(shí)分別于噴霧15 mL無菌LB液體培養(yǎng)基和50%腐霉利可濕性粉劑2 500倍液后24 h在刺傷處接種茄子灰霉病菌菌餅。接種后果實(shí)置于25 ℃、100%相對(duì)濕度下培養(yǎng)，定期觀察病斑擴(kuò)展情況，測(cè)定病斑面積并計(jì)算防治效果。每個(gè)處理接種3個(gè)果實(shí)，設(shè)置3次重復(fù)。計(jì)算公式如下：

防治效果（%）=（對(duì)照組病斑面積-處理組病斑面積）/對(duì)照組病斑面積×100

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZDC-01抑菌活性測(cè)定

通過對(duì)峙培養(yǎng)，對(duì)菌株ZDC-01的抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表1。可以看出，菌株ZDC-01對(duì)蘋果葉枯炭疽病菌、茄子灰霉病菌、白菜黑斑病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果輪紋病菌8株病原菌均有不同程度的抑制作用，抑菌帶寬度在17.8～23.2 mm之間。其中，對(duì)茄子灰霉病菌的抑菌活性最高，其抑菌帶寬度為23.2 mm；其次是蘋果葉枯炭疽病菌和棉花枯萎病菌，抑菌帶寬度分別為22.7、21.8 mm；對(duì)柑橘炭疽病菌的抑菌作用最差，抑菌帶寬度為17.8 mm。

2.2 菌株ZDC-01的抑菌機(jī)理

由表2可知，菌株ZDC-01無菌濾液、菌懸液對(duì)8種病原菌的抑制率存在顯著差異。菌懸液對(duì)8種病原菌的抑制率在88.35%～96.87%之間，而無菌濾液對(duì)病原菌的抑制率在0.35%～13.73%之間，無菌濾液處理的抑制率均顯著低于菌懸液處理的抑制率。菌懸液對(duì)茄子灰霉病菌的抑制率最高，達(dá)96.87%；其后是蘋果葉枯炭疽病菌和小麥赤霉病菌，抑制率分別為94.89%、94.53%；對(duì)柑橘炭疽病菌的抑制率最低，為88.35%。

2.3 菌株ZDC-01對(duì)茄子灰霉病的防治效果

由圖1可知，菌株ZDC-01發(fā)酵液、無菌濾液和菌懸液對(duì)茄子灰霉病均有一定的防治效果，菌株ZDC-01發(fā)酵液和菌懸液處理的防治效果與腐霉利處理的防治效果不存在顯著差異（P<0.05）；但無菌濾液的處理防效較差，7 d后防效僅為9.53%。噴施菌株ZDC-01發(fā)酵液和菌懸液后，防治效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)有所降低，從接種3 d后的92.57%、93.12%下降至7 d后的90.37%、89.76%，但仍與腐霉利處理效果相當(dāng)。

3 討論

本研究表明，地下芽孢桿菌Bacillus subterraneus抗菌譜廣、拮抗活性高；在抑菌機(jī)理的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，菌懸液主要起抑菌作用，抑菌率高達(dá)96.87%；室內(nèi)試驗(yàn)中，噴施發(fā)酵液、菌懸液的防效與腐霉利處理無顯著差異，而無菌濾液的防效較差，推測(cè)在抑菌過程中菌株活體起主導(dǎo)作用，而代謝產(chǎn)物的作用甚微。由于室內(nèi)與田間環(huán)境差異很大，對(duì)其能否應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐還需做進(jìn)一步的田間試驗(yàn)驗(yàn)證。另外，其發(fā)酵條件、運(yùn)輸及儲(chǔ)存方式等也需要深入研究。

目前，報(bào)道的芽孢桿菌主要是從陸地土壤中篩選得到，很少來自海洋[14-17]。由于海洋環(huán)境的極特殊性，如高壓、高鹽、低營養(yǎng)、低溫、無光照等特點(diǎn)都決定了生活于其中的微生物具有不同于陸地微生物的特點(diǎn)，使其代謝方式具有特異性，而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能獨(dú)特的天然活性代謝產(chǎn)物，具有重要的開發(fā)價(jià)值。因此，利用海洋微生物尋找新的藥物資源成為研究熱點(diǎn)[18]。

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