化州柚花揮發(fā)油的GC—MS分析及其對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖、遷移的影響研究

李武國(guó) 蘇喬 魏潔書 朱燁妍 劉翠婷 李雯雯 趙廣銀 黃浩機(jī) 詹若挺

摘 要 目的：提取化州柚花揮發(fā)油，鑒定其成分，并評(píng)價(jià)其對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖、遷移的體外抑制作用。方法：采用水蒸氣蒸餾法提取化州柚花揮發(fā)油；采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）分析其化學(xué)組成，以峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量；采用MTT法檢測(cè)其對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的抑制作用，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力和增殖抑制率；采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響，計(jì)算相對(duì)遷移面積和遷移抑制率。結(jié)果：從100 g化州柚花中提取得到揮發(fā)油0.7 g，得率為0.7%。共從中分離得到了46個(gè)組分，鑒定了其中35個(gè)組分，占總峰面積的96.95%；相對(duì)百分含量較高的化合物包括D-檸檬烯（28.43%）、γ-萜品烯（20.74%）、β-月桂烯（11.97%）、芳樟醇（7.41%）等。與空白對(duì)照組比較，120 mg/L化州柚花揮發(fā)油可顯著降低肺癌細(xì)胞A549的相對(duì)活力（P<0.05），增殖抑制率上升至21.72%；而1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549的相對(duì)活力均無(wú)顯著影響（P>0.05）。作用24、48 h時(shí)，60、120 mg/L化州柚花揮發(fā)油可顯著縮小肺癌細(xì)胞A549的相對(duì)遷移面積（P<0.05），遷移抑制率分別為132.46%、125.08%（24 h）和124.54%、124.66%（48 h）；而30 mg/L化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549的相對(duì)遷移面積均無(wú)顯著影響（P>0.05）。結(jié)論：GC-MS法可用于鑒定化州柚花揮發(fā)油的化學(xué)組成?；蓁只〒]發(fā)油以D-檸檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯等成分為主，對(duì)肺癌細(xì)胞A549的增殖、遷移能力具有一定的體外抑制作用。

關(guān)鍵詞 化州柚花；揮發(fā)油；氣質(zhì)聯(lián)用法；增殖；遷移；肺癌細(xì)胞A549；體外抑制作用

中圖分類號(hào) R284.1；R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）22-3093-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.15

ABSTRACT OBJECTIVE： To extract and identify the volatile oil from the flowers of Citrus grandis， and evaluate inhibitory effects of it on the proliferation and migration of lung cancer A549 cells in vitro. METHODS： The volatile oil was extracted from the flowers of C. grandis by steam distillation. The chemical constituents were analyzed by GC-MS. Relative percentage of each component was calculated by peak area normalization. Inhibitory effect of volatile oil on the proliferation of lung cancer A549 cells was detected by MTT assay， and the relative activity and proliferation inhibitory rate were calculated. Inhibitory effect of volatile oil on the migration of lung cancer A549 cells was evaluated by cell scratch test， and the relative migration area and migration inhibitory rate were calculated. RESULTS： Totally 0.7 g volatile oil was obtained from 100 g flowers of C. grandis with a yield of 0.7%. A total of 46 chemical components were isolated from the volatile oil， among which there were 35 compounds identified， accounting for 96.95% of the total peak area. The compounds with relatively higher percentage content included D-limonene （28.43%）， γ-terpinene （20.74%）， β-myrcene （11.97%） and linalool （7.41%）， etc. Compared with blank control group， 120 mg/L volatile oil from the flowers of C. grandis could significantly reduce the relative activity of lung cancer A549 cells （P<0.05）， and the proliferation inhibitory rate increased to 21.72%. The volatile oil from the flowers of C. grandis had no obvious inhibitory effects on the relative activity of lung cancer A549 cells at the concentration of 1， 5， 10， 20， 40， 60， 80， 100 mg/L （P>0.05）. After treated for 24， 48 h， the volatile oil from the flowers of C. grandis could significantly reduce the relative migration area of lung cancer A549 cells at the concentration of 60， 120 mg/L （P<0.05）； and the migration inhibitory rate were 132.46%， 125.08% （24 h） and 124.54%， 124.66% （48 h）， respectively. But 30 mg/L volatile oil from the flowers of C. grandis had no obvious inhibitory effects on the relative migration area of lung cancer A549 cells （P>0.05）. CONCLUSIONS： GC-MS can be used for identifying chemical compositions of volatile oil from the flowers of C. grandis. Volatile oil from the flowers of C. grandis are mainly D-limonene， γ-terpinene， β-myrcene， etc.， which can inhibit the the proliferation and migration of lung cancer A549 cells.

KEYWORDS Citrus grandis； Volatile oil； GC-MS； Proliferation； Migration； Lung cancer A549 cells； Inhibitory effect in vitro

化州柚花為蕓香科植物化州柚（Citrus grandis ‘tomentosa）的花。未成熟或近成熟化州柚的干燥外層果皮經(jīng)加工后可制成廣東省十大道地藥材之一的化橘紅，習(xí)稱“毛橘紅”，歸肺、脾經(jīng)，具有理氣寬中、燥濕化痰之功效，可用于治療咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶[1]。而化州柚花在化州當(dāng)?shù)匾脖恢瞥衫須饣档幕ú枳鞅＝∮肹2]。目前，化州柚花中已發(fā)現(xiàn)的藥用化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、黃酮類、檸檬苦素類和香豆素類等[2-5]，其中揮發(fā)油主要成分為萜類。在已報(bào)道的化州柚花揮發(fā)油成分中，D-檸檬烯能通過(guò)促進(jìn)自噬而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)肺癌細(xì)胞A549、H1299的抑制作用[6]；芳樟醇可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或氧化應(yīng)激反應(yīng)而對(duì)白血病[7]、胃癌、肺癌、皮膚癌[8]、肝癌[9]、直腸癌[10]等腫瘤產(chǎn)生抑制作用；金合歡醇能夠通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DU14的凋亡[11]。由此可見(jiàn)，化州柚花揮發(fā)油單一有效成分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有較強(qiáng)的體外抑制活性。因此歸肺經(jīng)的化州柚花，其揮發(fā)油整體是否具有體外抗肺癌活性值得探究。為此，本研究采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）對(duì)化州柚花揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，并初步探討其對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖、遷移的體外抑制作用，以期為化州柚花的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Class Ⅱ BSC型生物安全柜（新加坡Esco公司）；Biofuge Primo R型離心機(jī)、HERAcell 150i型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SUNNY-XD30型顯微鏡[舜宇光學(xué)科技（集團(tuán)）有限公司]；ZW-A型微量振蕩器（江蘇科析儀器有限公司）；Voyager型GC-MS儀，配有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)NIST 11、TG-WaxMS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）（美國(guó)Finnigan公司）；98-Ⅰ-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；1 000 mL揮發(fā)油提取器（北京博美華科玻璃有限公司）。

1.2 藥材與試劑

化州柚花由本課題組于2017年4月采摘自廣東省化州市文樓鎮(zhèn)某化州柚種植場(chǎng)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為蕓香科柑橘屬植物化州柚（C. grandis ‘tomentosa）的花，陰干后備用；其樣本（編號(hào)：YY10101）保存于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

胎牛血清（FBS，批號(hào)：42G5550K）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：8117108）、青鏈霉素（批號(hào)：1881450）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（0.25% Trypsin-EDTA）溶液（批號(hào)：1676922）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號(hào)：8117157）均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號(hào)：3580GR001，臨用前以PBS配制成質(zhì)量濃度為5 g/L的溶液）、二甲基亞砜（DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，批號(hào)：EZ1609C224）均購(gòu)于德國(guó)BioFroxx公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細(xì)胞

人肺癌細(xì)胞A549由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所李文德研究員贈(zèng)送。

2 方法

2.1 化州柚花揮發(fā)油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取。稱取干燥化州柚花100 g，置于揮發(fā)油提取器中，加6倍質(zhì)量的蒸餾水浸泡1 h后，蒸餾提取6 h，收集揮發(fā)油，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，稱重，計(jì)算得率[得率（%）=揮發(fā)油質(zhì)量/化州柚花質(zhì)量×100%]。

2.2 化州柚花揮發(fā)油樣品的處理

取上述揮發(fā)油樣品適量，用乙醚稀釋，配制成質(zhì)量濃度為50 g/L（以揮發(fā)油質(zhì)量計(jì)）的溶液，用無(wú)水硫酸鈉干燥后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液適量進(jìn)行GC-MS法分析。

取上述揮發(fā)油樣品適量，用DMSO稀釋，配制成質(zhì)量濃度為30 g/L（以揮發(fā)油質(zhì)量計(jì)）的溶液，作為體外試驗(yàn)的樣品貯備液。

2.3 GC-MS條件

2.3.1 GC條件 色譜柱：TG-WaxMS石英毛細(xì)管柱；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以6 ℃/min升至130 ℃，以2 ℃/min升至210 ℃，以20 ℃/min升至300 ℃；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；載氣：高純氦氣；載氣流量：1 mL/min（恒流模式）；分流比：20 ∶ 1；進(jìn)樣量：0.1 μL。

2.3.2 MS條件 電離源：電子轟擊（EI）電離源；電子轟擊能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；掃描方式：全譜圖掃描（Full scan）；掃描速度：2 200.19 amu/s；掃描范圍：m/z 33～450；溶劑延遲時(shí)間：3 min。

2.4 化州柚花揮發(fā)油成分相對(duì)含量的計(jì)算

使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)NIST 11進(jìn)行檢索匹配，通過(guò)人工質(zhì)譜圖解析并確證各化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，采用峰面積歸一化法計(jì)算其相對(duì)百分含量。

2.5 化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖能力的影響

采用MTT法[12]檢測(cè)化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖能力的影響。體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549，待其生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞適量，經(jīng)0.25% Trypsin-EDTA溶液消化后計(jì)數(shù)，按3 000個(gè)/孔接種至96孔板中，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和化州柚花揮發(fā)油不同劑量組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。吸棄各孔上清液，空白對(duì)照組加入含0.4% DMSO和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基100 μL，各給藥組分別加入含10% FBS和不同質(zhì)量濃度（1、5、10、20、40、60、80、100、120 mg/L，以揮發(fā)油質(zhì)量計(jì)；取“2.2”項(xiàng)下樣品貯備液各適量至DMEM培養(yǎng)基中即得，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[13-14]）化州柚花揮發(fā)油的DMEM培養(yǎng)基各100 μL，于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸棄各孔上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力（細(xì)胞相對(duì)活力=各組平均OD值/空白對(duì)照組平均OD值），并依據(jù)細(xì)胞相對(duì)活力計(jì)算增殖抑制率[增殖抑制率（%）=（1-各組平均細(xì)胞相對(duì)活力/空白對(duì)照組平均細(xì)胞相對(duì)活力）×100%][13，15]。

2.6 化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)[14]考察化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響。體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549，待其生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞適量，經(jīng)0.25% Trypsin-EDTA溶液消化后計(jì)數(shù)，按5×105個(gè)/孔接種至6孔板中，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和化州柚花揮發(fā)油不同劑量組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。吸棄各孔上清液，用200 μL移液槍頭垂直于6孔板背后提前畫好的橫線劃痕，制備體外傷口愈合模型[14]。用PBS清洗3次以除去各孔中的細(xì)胞殘骸或碎片?？瞻讓?duì)照組加入含0.4% DMSO的DMEM培養(yǎng)基2 mL，各給藥組分別加入含不同質(zhì)量濃度（30、60、120 mg/L，以揮發(fā)油質(zhì)量計(jì)；按“2.5”項(xiàng)下劑量倍數(shù)遞減）化州柚花揮發(fā)油的DMEM培養(yǎng)基2 mL，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。分別在孵育0、24、48 h時(shí)，置于倒置顯微鏡下拍照，并采用Image J 1.45軟件考察遷移面積，同時(shí)計(jì)算24、48 h時(shí)的相對(duì)遷移面積（遷移后無(wú)細(xì)胞區(qū)面積與0 h時(shí)無(wú)細(xì)胞區(qū)面積的差值）和遷移抑制率[遷移抑制率（%）=（1-各組平均相對(duì)遷移面積/空白對(duì)照組平均相對(duì)遷移面積）×100%][16]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和方差同質(zhì)性檢驗(yàn)分別考察數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x±s表示，其中方差齊的采用最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)，方差不齊的采用Dunnetts T3檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 化州柚花揮發(fā)油的得率及GC-MS分析

共提取得到化州柚花揮發(fā)油0.7 g，得率為0.7%。對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，其總離子流圖見(jiàn)圖1。

采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)NIST 11檢索圖1中的各色譜峰，并逐一核對(duì)、解析質(zhì)譜圖以確定各組分名稱和分子式；采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，本研究共分離得46個(gè)揮發(fā)油組分，共鑒定了其中35個(gè)組分，占總峰面積的96.95%，相對(duì)百分含量較高的化合物是D-檸檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯、芳樟醇、反-橙花叔醇，分別占28.43%、20.74%、11.97%、7.41%、5.00%，其中D-檸檬烯含量最高，是化州柚花揮發(fā)油最主要的化學(xué)成分。

3.2 化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖能力影響的檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，化州柚花揮發(fā)油120 mg/L組肺癌細(xì)胞A549的相對(duì)活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），增殖抑制率升至21.72%；而其他劑量組細(xì)胞相對(duì)活力與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表2。

3.3 化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移能力影響的檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，作用24、48 h時(shí)，30 mg/L化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549的相對(duì)遷移面積均無(wú)明顯的抑制作用，相對(duì)遷移面積組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；60、120 mg/L的化州柚花揮發(fā)油均能顯著抑制肺癌細(xì)胞A549的遷移能力，相對(duì)遷移面積組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），遷移抑制率分別為132.46%、125.08%（24 h）和124.54%、124.66%（48 h），詳見(jiàn)圖2、表3。

4 討論

本研究通過(guò)GC-MS法分析并鑒定了化州柚花揮發(fā)油的化學(xué)組成，共分離獲得46個(gè)化學(xué)組分峰，鑒定了其中35個(gè)組分，占總峰面積的96.95%；而其余組分由于含量太少或質(zhì)譜匹配度過(guò)低而無(wú)法進(jìn)行確證。黃蘭珍等[2]同樣采用水蒸氣蒸餾法提取了化州柚花的揮發(fā)油，并進(jìn)行了GC-MS分析，從中分離并鑒定了15個(gè)化合物，占總峰面積的82.318%，含量較高的化合物是橙花叔醇（19.27%）、松油烯（12.78%）、芳樟醇（9.87%）、蒎烯（8.54%）、金合歡烯（6.67%）。與之相比，本研究從化州柚花揮發(fā)油中分離鑒定的化合物更多、檢出率更高，且含量較高的5個(gè)化合物[D-檸檬烯（28.43%）、γ-萜品烯（20.74%）、β-月桂烯（11.97%）、芳樟醇（7.41%）、反-橙花叔醇（5.00%）]也不盡相同，這種差異可能與化州柚的種植環(huán)境不同、花的采集時(shí)間不同等因素有關(guān)[2，17]。韓寒冰等[18]通過(guò)無(wú)水乙醇超聲輔助提取化州柚花的化學(xué)成分，并運(yùn)用在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GPC-GC/MS）對(duì)其揮發(fā)油成分進(jìn)行分離鑒定，共分離出75個(gè)組分，鑒定出其中的38個(gè)，占總峰面積的96.20%，含量較高的化合物是橙花叔醇（19.57%）、β-月桂烯（14.46%）、法尼醇（13.99%）、γ-萜品烯（7.52%）、β-蒎烯（6.27%）。與本研究相比，上述研究從化州柚花揮發(fā)油中分離鑒定的化合物更多，含量較高的5個(gè)化合物也不盡相同，提示揮發(fā)油提取方法的不同也是造成其化學(xué)組成差異的原因之一[19-20]。

本研究采用MTT法初步考察了不同劑量化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的體外抑制作用。結(jié)果顯示，經(jīng)120 mg/L化州柚花揮發(fā)油作用后，A549細(xì)胞的相對(duì)活力較空白對(duì)照組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增殖抑制率升至21.72%；而其他劑量組細(xì)胞相對(duì)活力與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示高劑量的化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549的增殖具有較好的體外抑制作用。此外本研究GC-MS分析結(jié)果顯示，化州柚花揮發(fā)油中含量最高的化合物是D-檸檬烯。Yu X等[6]在研究中指出，D-檸檬烯（102 mg/L）作用24 h后，肺癌細(xì)胞A549的增殖受到了明顯的抑制；同時(shí)該研究還指出，D-檸檬烯能夠抑制肺癌細(xì)胞A549克隆形成，促進(jìn)其細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)其凋亡，具有顯著的抗肺癌活性。由此可見(jiàn)，D-檸檬烯可能是化州柚花揮發(fā)油抑制肺癌細(xì)胞A549增殖的主要活性成分之一。

本研究采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)了化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響。該模型是經(jīng)典的細(xì)胞遷移能力評(píng)價(jià)方法。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，作用24、48 h時(shí)，30 mg/L化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549的遷移能力均無(wú)明顯的抑制作用，相對(duì)遷移面積組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；60、120 mg/L化州柚花揮發(fā)油均能顯著抑制肺癌細(xì)胞A549的遷移能力，相對(duì)遷移面積組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，遷移抑制率分別為132.46%、125.08%（24 h）和124.54%、124.66%（48 h）。在研究過(guò)程中筆者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)60、120 mg/L化州柚花揮發(fā)油作用后，A549細(xì)胞的輪廓不清晰，疑似處于凋亡狀態(tài)，同時(shí)其遷移抑制率較空白對(duì)照組和化州柚花揮發(fā)油30 mg/L組均明顯升高，提示這種抑制作用可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)，但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。此外相關(guān)研究指出，D-檸檬烯能促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549發(fā)生自噬，并誘導(dǎo)其凋亡[6]，表明該化合物可能是化州柚花揮發(fā)油抑制細(xì)胞遷移的主要活性成分之一。

綜上所述，本研究采用GC-MS法從化州柚花揮發(fā)油中分離鑒定了35個(gè)化合物，以D-檸檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯等成分為主。體外試驗(yàn)結(jié)果表明，120 mg/L化州柚花揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞A549的增殖能力具有明顯的抑制作用；60、120 mg/L化州柚花揮發(fā)油對(duì)其遷移能力亦具有明顯的抑制作用，但其具體作用機(jī)制仍有待后續(xù)深入探討。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2015年版. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：74-75.

[ 2 ] 黃蘭珍，林勵(lì). 化州柚果皮、花、葉有效成分的比較研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2008，19（3）：213-215.

[ 3 ] 孫國(guó)玲. 毛橘紅化學(xué)成分及其代謝研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2010.

[ 4 ] 伍柏堅(jiān)，林勵(lì)，陳康，等. 化州柚花不同花期黃酮類成分含量的動(dòng)態(tài)變化研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2007，18（5）：377-379.

[ 5 ] 伍柏堅(jiān)，林勵(lì)，陳康，等. 化州柚成花過(guò)程總黃酮指紋圖譜的動(dòng)態(tài)變化研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2008，22（5）：15-18.

[ 6 ] YU X，LIN H，WANG Y，et al. D-limonene exhibits antitumor activity by inducing autophagy and apoptosis in lung cancer[J]. Onco Targets Ther，2018. DOI：10.2147/OTT.S155716.

[ 7 ] GU Y，ZHANG T，QIU X，et al. Linalool preferentially induces robust apoptosis of a variety of leukemia cells via upregulating p53 and cyclin-dependent kinase inhibitors[J]. Toxicology，2010，268（1/2）：19-24.

[ 8 ] CHERNG JM，SHIEH DE，CHIANG W，et al. Chemopreventive effects of minor dietary constituents in common foods on human cancer cells[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2007，71（6）：1500-1504.

[ 9 ] USTA J，KREYDIYYEH S，KNIO K，et al. Linalool decreases HepG2 viability by inhibiting mitochondrial complexesⅠandⅡ，increasing reactive oxygen species and decreasing ATP and GSH levels[J]. Chem Biol Interact，2009，180（1）：39-46.

[10] IWASAKI K，ZHENG Y，MURATA S，et al. Anticancer effect of linalool via cancer-specific hydroxyl radical generation in human colon cancer[J]. World J Gastroenterol，2016，22（44）：9765-9774.

[11] PARK JS，KWON JK，KIM HR，et al. Farnesol induces apoptosis of DU145 prostate cancer cells through the PI3K/Akt and MAPK pathways[J]. Int J Mol Med，2014，33（5）：1169-1176.

[12] 何紫凝，劉嘉煒，李武國(guó)，等. 兩面針根和莖超臨界CO2萃取物GC-MS比較分析及體外細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)中藥雜志，2014，39（4）：710-714.

[13] 盛萍，王颯，苗莉娟，等. 不同方法提取的多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分及其體外抗胃癌活性比較[J]. 中成藥，2013，35（11）：2442-2448.

[14] 李武國(guó)，劉嘉煒，李慶國(guó)，等. 虎杖根莖超臨界CO2萃取物GC/MS分析及抗細(xì)胞遷移活性評(píng)價(jià)[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2014，35（5）：420-426.

[15] 黃冬苑，劉嘉煒，李武國(guó)，等. 陵水暗羅根超臨界CO2萃取物的GC-MS分析及其體外生物活性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)藥房，2016，27（1）：15-18.

[16] 杜娜，李健，劉福生，等. 雷公藤紅素對(duì)AGS細(xì)胞遷移的影響[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10（5）：623-626.

[17] 劉慧燕，蘇薇薇，彭維. 生態(tài)環(huán)境對(duì)化橘紅道地性的影響研究[J]. 中國(guó)園藝文摘，2015，31（5）：216-218.

[18] 韓寒冰，張啟，魏國(guó)程，等. 南藥化橘紅花果葉中揮發(fā)油成分比較分析[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，24（7）：33-36.

[19] 施錚，陳仁壽，陳勇. 不同方法提取的柴胡揮發(fā)油化學(xué)成分比較[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31（6）：576-578.

[20] 張敏，趙梅，印酬，等. 3種不同提取方法對(duì)蜘蛛香揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（8）：3312-3317.

（收稿日期：2018-05-30 修回日期：2018-08-28）

（編輯：張?jiān)拢?/p>