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    基于高效液相色譜法優(yōu)化測定7種混合單糖的研究*

    2018-10-19 07:52:48常青
    福建輕紡 2018年10期
    關(guān)鍵詞:阿拉伯糖單糖木糖

    常青

    (福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州,350002)

    目前測定單糖的方法主要有高效液相色譜法[1]、氣相色譜法[2]、離子色譜法[3]和毛細(xì)管電泳法[4]等,其中高效液相色譜法為單糖分析的重要方法之一,因其操作簡單,分離效果好,靈敏度高受到廣大研究者的青睞。高效液相色譜法測定單糖的方法主要分為衍生法和非衍生法,衍生法又分為PMP柱前衍生法和柱后衍生法。無論是柱前衍生法還是柱后衍生法操作都比較復(fù)雜,柱前衍生容易帶入雜質(zhì),產(chǎn)生誤差,柱后衍生法的成本較高。郝桂堂等[5]采用熒光檢測法和紫外檢測法分析了9種單糖,發(fā)現(xiàn)幾種單糖的分離度不好。段月等[6]采用柱前衍生法檢測枸杞多糖中的單糖組成,雖能有效地分離出幾種單糖,但其分離時(shí)間長。而非衍生法一般采用示差折光檢測器結(jié)合糖分析柱進(jìn)行分析,此法的優(yōu)點(diǎn)在于無需衍生處理、操作簡單和效率高,應(yīng)用更廣泛[7]。歐陽華學(xué)等[8]采用示差折光檢測法同時(shí)檢測了枸杞中3種單糖和2種低聚木糖,且加標(biāo)回收率較高。

    因此,本文采用非衍生法,通過示差折光檢測器結(jié)合糖分析柱將7種不同的混合單糖進(jìn)行分離,以期為分析多糖中單糖組分提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    1.1.1 試劑

    葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、果糖和半乳糖均為色譜純購自sigma公司,超純水(實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)制備),乙腈(色譜純)。

    1.1.2 儀器

    Waters e2695高效液相色譜儀:美國Waters公司;

    Waters 2414示差折光檢測器:美國Waters公司;

    Q-Gard A2超純水機(jī):法國Mingche公司;

    SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵:鄭州紫拓儀器設(shè)備有限公司;

    KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器設(shè)備有限公司;

    津騰聚醚砜(0.45μm):歐美國家進(jìn)口膜。

    1.2 色譜條件

    色譜柱:ZORBAX糖分析柱(Agilent 4.6 mm×250 mm,5μm);

    流動(dòng)相:不同濃度的乙腈(超聲后使用),流速:0.5~1.0 mL/min,柱溫:25~35 ℃,檢測器溫度:30 ℃,進(jìn)樣量10μL。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的篩選得到流速在0.8 mL/min、柱溫35 ℃時(shí)其分離效果最佳,因此共設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn),具體如表1所示。

    表1 色譜條件

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

    分別稱取10 mg的葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、果糖和半乳糖用超純水定容至10 mL,超聲后過0.45μm的水相濾膜。取等量過膜后的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液混合作為混合標(biāo)品。

    1.4 定性分析

    進(jìn)行7種混合游離單糖標(biāo)準(zhǔn)品測定時(shí),如果混合標(biāo)品的出峰時(shí)間與單標(biāo)一致,保留時(shí)間偏差在±5%,則可以確定混合標(biāo)品中各個(gè)峰所對應(yīng)的單糖物質(zhì)。

    1.5 相對保留值的計(jì)算

    相對保留值是指在一定色譜條件下2個(gè)被測組分調(diào)整保留時(shí)間之比,其計(jì)算公式為:

    式中:TR(1)——相鄰2個(gè)峰中第1個(gè)峰的調(diào)整保留時(shí)間;

    TR(2)——相鄰2個(gè)峰中第2個(gè)峰的調(diào)整保留時(shí)間。

    1.6 分離度的計(jì)算

    分離度(R)表示相鄰2個(gè)色譜峰分離程度的優(yōu)劣,其計(jì)算公式為:

    式中:tR(1)——相鄰2個(gè)峰中第1個(gè)峰的保留時(shí)間;

    tR(2)——相鄰2個(gè)峰中第2個(gè)峰的保留時(shí)間;

    W1和W2——分別為2峰的峰底寬。

    1.7 數(shù)據(jù)處理

    采用Empower 3軟件進(jìn)行相對保留值和分離度的計(jì)算,OriginPro 8.5繪制圖形,SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    由圖1可知組別1乙腈濃度為75%時(shí)的分離效果最差,不能很好的將7種單糖分離開來,因此只對組別2、3、4的相對保留值和分離度進(jìn)行分析。

    圖1 7種混合單糖的色譜圖

    表2 相鄰兩峰之間的相對保留值

    表3 相鄰兩峰之間的分離度

    2.1 相對保留值的計(jì)算

    相對保留值反應(yīng)了2個(gè)被測組分的分離效果,相對保留值受固定相的種類、柱溫以及流動(dòng)相組成的影響,因此可以通過改變固定相的種類、柱溫以及流動(dòng)相的組成,以達(dá)到滿意的分離效果[9]。表2是2,3,4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對保留值,由表2可知,流動(dòng)相乙腈濃度為85%時(shí),核糖和木糖兩峰之間、甘露糖和葡萄糖兩峰之間的相對保留值顯著高于流動(dòng)相乙腈濃度為83%和80%的相對保留值,說明流動(dòng)相乙腈濃度為85%時(shí)核糖和木糖、甘露糖和葡萄糖其分離效果較好;流動(dòng)相乙腈濃度為85%時(shí),木糖和阿拉伯糖兩峰之間、阿拉伯糖和果糖兩峰之間、果糖和甘露糖兩峰之間的相對保留值與流動(dòng)相乙腈濃度為80%的相對保留值無顯著差異,但顯著高于流動(dòng)相乙腈濃度為83%的相對保留值;而葡萄糖和半乳糖兩峰之間的相對保留值均無顯著性差異。因此,當(dāng)乙腈濃度為85%時(shí),其相對保留值較高,其分離效果較好。

    2.2 分離度的計(jì)算

    表3是2,3,4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分離度,由表3可知,流動(dòng)相乙腈濃度為85%時(shí),木糖和阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖、葡萄糖和半乳糖的分離度顯著高于流動(dòng)相乙腈濃度為83%和80%時(shí)的分離度;3種乙腈濃度對核糖和木糖、果糖和甘露糖的分離度無顯著影響;而對于阿拉伯糖和果糖,85%和83%的乙腈濃度對其分離度無顯著影響,但顯著高于乙腈濃度為80%時(shí)的分離度。因此當(dāng)乙腈濃度為85%時(shí),7種混合單糖的分離效果較好。

    3 結(jié)論

    綜合考察相對保留值和分離度,采用示差檢測器、ZORBAX糖分析柱,當(dāng)乙腈濃度為85%時(shí),葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、果糖和半乳糖能較好的分離,其相對保留值和分離度較乙腈濃度為80%和83%時(shí)的相對保留值較高,分離效果較好。

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