氧化石墨烯促進NIH3T3細胞在石墨烯/明膠納米膜上的增殖與粘附的實驗研究*

孫巖峰，劉偉，沈遠，楊皛寧，朱惠敏，馬金旭，周瑾△

(1.軍事醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所 前沿交叉學科研究室，北京 100080；2.武警總醫(yī)院 兒科 臨床腫瘤，北京 100080)

1 引 言

近年來，納米生物材料已廣泛用于生物醫(yī)學研究領域[1-2]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)作為石墨烯的衍生物，在醫(yī)學相關領域的研究得到高度重視。同時因其表面富含-OH、-COOH、-C=O等大量親水含氧官能團，因此，具有良好的水溶性及生物相容性[3-4]。

氧化石墨烯在生物應用方面也越來越廣泛。新近研究表明，氧化石墨烯可與多種生物分子結合，通過攜帶小分子藥物、基因、抗體、蛋白等，最終實現(xiàn)藥物遞送[5-7]。其作為組織工程的支架材料等方面同樣具有一定優(yōu)勢[8]，已有報道證實氧化石墨烯對骨細胞的粘附、分化及增殖有一定的影響[9-11]。且石墨烯作為新的涂層材料可加速人間充質干細胞向成骨的分化[12-13]。然而目前成纖維細胞在氧化石墨烯涂覆基材上的生長、粘附行為的相關研究較為少見。成纖維細胞作為組織工程研究中一種重要的種子細胞，具有較好的增殖、膠原沉積、細胞因子的分泌等能力，一定程度上決定著基質的重塑和組織構架的形成質量。因此，探索該材料對成纖維細胞的生物學行為的影響對未來氧化石墨烯在組織工程修復及重建方面的研究至關重要。

本研究選取氧化石墨烯作為涂層材料，與明膠混合，制備氧化石墨烯/明膠涂覆材料，并將小鼠成纖維細胞系NIH3T3細胞接種在材料上。本研究旨在探索氧化石墨烯對NIH3T3細胞的活性，增殖及粘附等相關特性的影響，為后續(xù)納米材料在組織工程構建方面的生物安全性及生物相容性研究提供參考。

2 材料和方法

2.1 實驗細胞系和試劑

小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3。氧化石墨烯(TIME Nano)，高糖DMEM培養(yǎng)液 (HyClone)，0.25%胰蛋白酶(含EDTA，HyClone)，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，TBD science)，Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本同仁)，細胞活性染色試劑盒 (Invitrogen)，反轉錄試劑盒 (Toyobo)，實時定量 PCR 試劑盒 (Toyobo)。

2.2 方法

2.2.1細胞培養(yǎng) 小鼠胚胎成纖維細胞株NIH3T3體外培養(yǎng)于含 10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中，隔日換液。細胞培養(yǎng)至90% 融合時，按 1:3比例體外傳代培養(yǎng) (37℃，5% CO2)。

2.2.2氧化石墨烯/明膠膜的制備 稱取1 mg氧化石墨烯，加入1 mL明膠(1 mg/mL)，制備1 mg/mL濃度的氧化石墨烯明膠溶液。超聲使其徹底溶解后滴加到細胞爬片上，置于60℃烘箱中，烘干過夜。培養(yǎng)細胞前置于75%乙醇中浸泡消毒過夜。

2.2.3掃面電鏡檢測氧化石墨烯/明膠膜的超微結構 將制備的樣品用掃描電鏡觀察細胞在支架上生長的形貌。載物臺貼上導電膠后，將制備的明膠涂覆材料、氧化石墨烯/明膠涂覆材料貼附在導電膠上后進行噴金，掃描電鏡觀察，拍照。

2.2.4細胞活性檢測 選取培養(yǎng)了48 h的明膠及氧化石墨烯/明膠膜上NIH3T3細胞，棄去培養(yǎng)基，添加10%CCK-8試劑，并于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，吸取200 μl孵育液于96孔板中，并利用酶標儀檢測450 nm波長下的OD值。

同時，選取在氧化石墨烯/明膠膜上培養(yǎng)48 h的NIH3T3細胞，PBS 沖洗三遍后，根據(jù)活 - 死細胞染色 (live/deadstaining) 試劑盒操作說明，分別對活細胞和死細胞染色1 h，熒光焦顯微鏡(Leica SP8，德國) 觀察氧化石墨烯/明膠膜上的細胞活性。

2.2.5細胞增殖能力檢測 將細胞接種到單純明膠組及氧化石墨烯/明膠組涂覆的材料上，分別選取兩組中平行的 3 個孔，根據(jù)CCK-8試劑操作說明，選取培養(yǎng)第1， 3， 5， 7 d的NIH3T3細胞，分別棄去培養(yǎng)液，添加10% CCK-8試劑并于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，利用酶標儀檢測對應 OD 值，利用Origin 7.0 軟件擬合，繪制生長曲線。

2.2.6vimentin免疫熒光染色 選取培養(yǎng)48 h的明膠及氧化石墨烯/明膠膜上的細胞，4%多聚甲醛溶液固定，依次進行脫水，用含0.3% Triton100破膜及用5%山羊血清封閉30 min后加一抗(抗vimentin抗體)，一抗按 1:300 稀釋，加入500 μL，4℃孵育過夜，隨后用 PBS 清洗3遍后加入二抗(山羊抗小鼠)室溫放置1.5 h，染色后用 PBS浸洗3次，最后加DAPI染細胞核5 min，用PBS浸洗后，熒光顯微鏡(Leica SP8，德國 )下觀察染色結果。

2.2.7實時定量 RT-PCR 檢測粘附相關的基因表達水平 收集實驗組及對照組細胞，利用 Trizol 法提取細胞總 RNA，使用RT-PCR kit(Toyobo)將RNA反轉錄為cDNA，并采用SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit(Toyobo)進行實時定量PCR檢測。根據(jù)NCBI 中cDNA序列，設計引物，以β-actin mRNA作為檢測的內參照，序列：β -Actin：上游：5’ -GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’，下游：5’ -CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTT-3’。PCR 反應引物序列如下：α -actin：上游：5’-ATCTGGCACCACACCTTCTA-3’，下游：5’-AGCTCGTAGCTCTTCTCCAG-3’;collagen I：上游：5’-ACTGGTACATCAGCCCGAAC-3’；下游：5’ -GGTGGAGGGAGTTTACACGA-3’；collagenIII：上游： 5’ -GCTGGCATTCCTCAGACTTC-3’ ，下游：5’ - TAGTCTCATTGCCTTGCGTG-3’ ；vinculin ：上游：5’ -AGCAGGAGTTGACTCACCAG-3’，下游：5’ -TCTAAGATCTGCCTGATGGC-3’ 。實時熒光定量 PCR 反應體系包括： cDNA 2 μL，引物(1 μmol/L) 2 μL， SYBR green 染料(2×) 10 μL， Nuclease-Free H2O 6 μL，總反應體系為 20 μL。反應條件：95℃ 30 s， 95℃ 3 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s，共42個循環(huán)。PCR反應的特異性通過產物熔解曲線進行確認，根據(jù) PCR反應曲線得到樣品目的基因和β-actin的Ct值。以2-ΔΔCt的值進行相對定量。

2.2.8Western blotting 檢測Vimentin表達水平 將培養(yǎng)的細胞消化離心后得細胞沉淀，利用 RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 工作液繪制蛋白標準曲線，并檢測樣品濃度。利用12% 分離膠SDS-PAGE將對應蛋白轉移至NC膜上，脫脂牛奶封閉，一抗 (1:1 000)4 ℃ 孵育過夜，T-TBS 清洗，二抗

(1:3000)室溫孵育2 h 后，T-TBS 清洗，滴加發(fā)光液，并在暗室利用顯影液，定影液進行條帶顯影。利用 Image J 圖像分析軟件進行圖像灰度掃描測定，得出目的蛋白與內參蛋白 (GAPDH)的灰度比值，即為目的蛋白表達水平的半定量指標。

2.2.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，且計量資料以 mean±SD 表示，組間比較采用t檢驗，*P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 掃描電鏡檢測材料表面的微觀結構

掃描電鏡結果顯示單純明膠涂覆材料與氧化石墨烯/明膠材料二者的表面形貌存在較大差異。明膠材料表面光滑，材料表面較為平整，無明顯褶皺結構存在，見圖1a。而添加氧化石墨烯后，材料表面明顯變得粗糙，氧化石墨烯/明膠膜表面起伏不平整，且存在許多凸起與凹陷，具有明顯的微米級褶皺結構，但整個表面較為柔和，見圖1b。這兩種材料表面形貌上的差異很可能是導致細胞生物學行為不同的主要原因。

圖1掃面電鏡檢測材料表面的微觀結構

a.單獨明膠膜的表面較為光滑；b.氧化石墨烯/明膠膜表面起伏不平，較為粗糙

Fig1Themicrostructureofthematerialwasexaminedbyscanningelectronmicroscopy

a. The microstructure of the gelatin membrane was smooth. b.The microstructure of GO/gelatin membrane was rough

3.2 活性及生長曲線分析

NIH3T3細胞接種到明膠及氧化石墨烯/明膠膜上，Live/Dead Staining結果顯示，在培養(yǎng)48 h后，氧化石墨烯/明膠膜上的NIH3T3細胞分布均勻，清晰，絕大部分被染上綠色熒光，細胞活性良好，而被染上紅色的死細胞較少，證明該材料的細胞生物相容性較好，見圖2a。CCK-8檢測細胞活性結果進一步證實，與明膠組相比，接種在氧化石墨烯/明膠膜上NIH3T3細胞活性良好，對細胞沒有明顯的細胞毒性，見圖2b。

生長曲線測定結果顯示：隨著培養(yǎng)時間的延長，兩組材料上測定的細胞吸光度值均增高，間接表明粘附的細胞數(shù)逐漸增多。且在培養(yǎng)的第3，5，7 d時，氧化石墨烯/明膠培養(yǎng)組的細胞吸光度值均高于單純明膠組，細胞呈現(xiàn)明顯增殖現(xiàn)象，見圖2c。

3.3 材料表面細胞Vimentin基因及蛋白的表達

為了檢測NIH3T3細胞在氧化石墨烯/明膠膜上的粘附，利用實時定量RT-PCR檢測細胞vimentin的表達，結果顯示：與對照組相比，GO/gelatin材料表面的vimentin mRNA的表達顯著提高(**P<0.01),見圖3a。進一步利用免疫熒光染色檢測細胞vimentin的表達，結果顯示：在氧化石墨烯/明膠膜的NIH3T3細胞顯示出完整的細胞骨架結構，且與單純明膠組相比，能清晰的觀察到細胞偽足延伸，細胞呈梭形，細胞骨架結構更為清晰。而明膠組中的細胞未有明顯的細胞骨架延伸，見圖3b。同時，我們利用Westernblotting進行了Vimentin蛋白表達的驗證，結果顯示實驗組的Vimentin的表達顯著高于對照組，為對照組的1.6倍(*P<0.05)，見圖3c。

圖2 明膠及氧化石墨烯/明膠膜上NIH3T3細胞的活性及增殖能力檢測

Fig2TheactivityandproliferationofNIH3T3cellsongelatinandgraphene/gelatinmembranesweredetected

a. Cell viability was observed by live-dead staining； b. Cell viability on cell gelatin and graphene/gelatin membrane was detected by CCK-8； c. Growth curve of the NIF3T3 cells on gelatin and graphene/gelatin membrane was detected by CCK-8 kit

圖3 NIH3T3細胞在不同材料上Vimentin的表達水平

Fig3TheexpressionlevelsofVimentinofNIH3T3cellsongelatinandGO/gelatinmembraneswasobserved

a. The expression levels of Vimentin of NIH3T3 cells was detected by RT-QPCR； b. by Western blotting； c. The expression levels of Vimentin of NIH3T3 cells was detected by Immunofluorescence

3.4 細胞粘附相關基因表達

實時定量 RT-PCR 檢測結果顯示，與單純明膠培養(yǎng)組相比，加入氧化石墨烯后培養(yǎng)的NIH3T3細胞α-actin、ColⅠ、ColⅢ、及Vinculin mRNA的表達均顯著增高，且差異具有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)，見圖4。

圖4不同材料上NIH3T3細胞α-actin、ColⅠ、ColⅢ、及VinculinmRNA表達水平。

Fig4Expressionlevelsofα-actin、ColⅠ、ColⅢandVinculinmRNAofNIH3T3cellsindifferentgroupsdetectedbyrealtimeRT-PCR.Mean±SD,n=3. *P< 0.05; **P<0.01

4 討論

氧化石墨烯作為新興的碳納米材料近年來受到研究者的廣泛關注。目前已有大量研究證實石墨烯在藥物遞送[14]、創(chuàng)傷愈合、組織工程修復[11，15]等研究中應用廣泛。然而對氧化石墨烯的生物安全性等方面的研究依然處于起步階段，尤其在組織工程方面的研究，其作為植入物的表面涂層材料，對其生物相容性及安全性的考察至關重要，還需要研究者進一步探討。

本研究嘗試將小鼠胚胎成纖維細胞系(NIH3T3)接種到氧化石墨烯/明膠膜上，探索氧化石墨烯的生物相容性及對成纖維細胞粘附的影響。結果顯示，加入氧化石墨烯后，細胞生長狀態(tài)良好，無明顯毒性。生長曲線測定結果證實在氧化石墨烯/明膠膜上培養(yǎng)的細胞增殖速度明顯高于單獨明膠培養(yǎng)組。分析原因可能是由于氧化石墨烯/明膠膜大量的凸起與凹陷為成纖維細胞的增殖提供了更多的空間。且這種機械性能較強，導電性能較好的納米材料會在一定程度上調控細胞周期的改變進而促進細胞的增殖。

利用掃面電鏡檢測材料表面的微觀結構，發(fā)現(xiàn)加入氧化石墨烯后材料表面變得粗糙，推測這種氧化石墨烯支架材料表面形成的納米和微米級的褶皺結構可能會在一定程度上增強細胞與材料的表面接觸面積，以及粘附強度的增加。實時定量PCR檢測結果進一步證實了氧化石墨烯的摻入的確可以使成纖維細胞分泌更多的膠原，以及增強細胞在材料表面的伸展、粘附。而這種特性更有利于研究者進一步將氧化石墨烯作為植入物的表面涂層材料，推動其在生物醫(yī)學方面的應用。

本研究通過比較二維明膠膜及氧化石墨烯/明膠薄膜對成纖維細胞增殖和粘附的影響，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯/膠原薄膜可以有效的促進細胞增殖、粘附和延伸。進一步證實氧化石墨烯作為植入物的表面涂層材料，具有很高的生物應用潛力，顯示出較好的生物相容性。