基于多肽均相裂解電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)前列腺特異性抗原

李哲建，張 靜，樊雪梅，王書民，曹寶月，周春生

(1.商洛學(xué)院 化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.西北化工研究院，陜西 西安 710062)

前列腺特異性抗原(PSA)是一種在正常的前列腺細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中分泌的蛋白酶，是診斷前列腺癌和乳腺癌的最廣泛使用的蛋白之一[1-2]。檢測(cè)PSA的方法有酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[3]、比色免疫分析法[4]、熒光免疫分析法[5]、表面增強(qiáng)拉曼散射免疫分析法[6]、電化學(xué)免疫分析法[7]、化學(xué)發(fā)光法[8]及電化學(xué)發(fā)光分析法[9]。上述方法大多基于抗原與抗體之間的免疫反應(yīng)，能夠高靈敏和選擇性地檢測(cè)PSA，但存在檢測(cè)步驟復(fù)雜、成本高、耗時(shí)較長(zhǎng)，穩(wěn)定性差，抗原結(jié)合活性位點(diǎn)暴露，以及蛋白質(zhì)抗體易變性等問題。在酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中，必須使用夾心法測(cè)量疾病標(biāo)志物的濃度，所以在每個(gè)特定位點(diǎn)應(yīng)至少結(jié)合兩個(gè)抗體，而重復(fù)洗滌步驟可能使抗體流失并降低檢測(cè)效率。因此，尋找新的識(shí)別分子，開發(fā)更穩(wěn)定、更快速和更簡(jiǎn)單的檢測(cè)PSA的生物傳感系統(tǒng)很有必要。

多肽作為抗體的替代物，具有易合成、成本低、穩(wěn)定、不易失活、適于極端條件以及無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。近年來，已有利用蛋白酶催化裂解某種序列特異性多肽的傳感器報(bào)道。Zhao等[12]建立了檢測(cè)PSA的電化學(xué)方法，利用二茂鐵標(biāo)記的螺旋肽作為分子識(shí)別物質(zhì)，通過檢測(cè)PSA酶切掉二茂鐵的電化學(xué)信號(hào)來測(cè)定PSA。Wang等[13]利用基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的酶催化切割多肽反應(yīng)構(gòu)建了檢測(cè)MMP-2的熒光生物傳感器，檢出限達(dá)32 pmol/L。進(jìn)一步研制具有高選擇性和高靈敏度的新型蛋白酶檢測(cè)方法對(duì)于蛋白酶相關(guān)疾病的診斷和治療藥物的開發(fā)具有重要意義。

圖1 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器測(cè)定PSA的原理圖Fig.1 Principle scheme of the fabrication of ECL biosensors

電化學(xué)發(fā)光法(ECL)是化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，具有儀器簡(jiǎn)單、分析靈敏度高、易控制和檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)[14]。基于酶催化切割探針生物分析系統(tǒng)并利用金納米粒子(AuNPs)離心分離的均相檢測(cè)PSA的電化學(xué)發(fā)光分析法尚未見報(bào)道。在文獻(xiàn)[12，15]基礎(chǔ)上，本文設(shè)計(jì)了一個(gè)基于生物切割電化學(xué)發(fā)光多肽探針與AuNPs離心分離的均相檢測(cè)PSA的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器(如圖1)。以多肽(CHSSKLQK)為分子識(shí)別物質(zhì)，釕聯(lián)吡啶衍生物(Ru1)為信號(hào)物質(zhì)，AuNPs為載體，建立了多肽納米金粒子電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PSA的新方法。釕聯(lián)吡啶衍生物通過酰胺化反應(yīng)標(biāo)記在肽的K端作為電化學(xué)發(fā)光探針(peptide-Ru1)；電化學(xué)發(fā)光探針利用末端C上的巰基自組裝在AuNPs上，構(gòu)成AuNPs電化學(xué)發(fā)光探針，由于PSA能特異性催化裂解該肽，使信號(hào)物質(zhì)從AuNPs上脫離；離心分離后，通過對(duì)溶液中的信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物PSA的高靈敏檢測(cè)。本文對(duì)ECL生物傳感器性能進(jìn)行了研究，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

釕聯(lián)吡啶衍生物[Ru(bpy)2(mcbpy-O-Su-ester)(PF6)2，縮寫為Ru1]、前列腺特異性抗原(PSA)、氯金酸、檸檬酸鈉均購(gòu)自Sigma公司。多肽(氨基酸序列：CHSSKLQK，MW=929.48)，純度大于95%，購(gòu)自上海楚肽生物科技有限公司。凝血酶購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。牛血清白蛋白、胰蛋白酶，購(gòu)自西安沃爾森生物科技有限公司。三正丙胺(TPA)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

電化學(xué)發(fā)光測(cè)量在MPI-E型電化學(xué)發(fā)光儀(西安瑞邁電子公司)上進(jìn)行。三電極體系：以裸玻碳電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl(飽和氯化鉀)作為參比電極。用UV-2450紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu 公司)記錄紫外可見光吸收光譜圖。JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM，日本JEOL公司)。

1.2 AuNPs的合成

參考文獻(xiàn)[9]合成AuNPs。將100 mL 0.01%的氯金酸溶液加熱攪拌，沸騰后迅速加入4 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色由淡黃色變?yōu)樽霞t色，最終變?yōu)榻鸺{米特有的紅色，繼續(xù)加熱和攪拌約15 min，直至溶液顏色變?yōu)橥该鞯某燃t色后，停止加熱，在室溫下冷卻后，將該溶液裝入棕色瓶置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AuNPs復(fù)合物的合成

取0.4 mg多肽(CHSSKLQK，0.000 43 mmol)溶于1 mL 10 mmol/L 磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)中，加入200 μL 5 mg/mL納米金混合后，置于恒溫?fù)u床上緩慢振蕩反應(yīng)4 h，使肽的末端C通過金硫鍵結(jié)合到金納米粒子表面。待反應(yīng)完全后，用10 mmol/L的PBS清洗未反應(yīng)的肽，離心分離完全后，將得到的AuNPs-peptide懸浮于1 mL 10 mmol/L PBS 中，將150 mL 3.5 mg/100 μL Ru1的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，加至攪拌的1 mL 0.25 mg/mL寡肽溶液中，室溫、避光下置于恒溫?fù)u床上反應(yīng)12 h。Ru1 通過?；磻?yīng)共價(jià)結(jié)合到肽的另一端K端。同理，用10 mmol/L PBS清洗未反應(yīng)的Ru1，通過離心分離器進(jìn)行分離。將得到的AuNPs-peptide-Ru1重新懸浮于0.1% BSA中，37 ℃條件下反應(yīng)2 h以對(duì)AuNPs表面未共價(jià)多肽的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉。對(duì)反應(yīng)得到的AuNPs電化學(xué)發(fā)光探針(AuNPs-peptide-Ru1)進(jìn)行沖洗，離心分離后，將探針加至600 μL 10 mmol/L的 PBS緩沖液中在2～8 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｔ趨⑴c反應(yīng)的AuNPs不損失的前提下，根據(jù)AuNPs的加入量，計(jì)算得電化學(xué)發(fā)光探針的質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL。

1.4 PSA的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

取10 μL金納米粒子電化學(xué)發(fā)光探針(1.6 mg/mL)加至90 μL不同濃度的PSA溶液或血清溶液中，在30 ℃下反應(yīng)40 min，將反應(yīng)后的混合液離心分離5 min。切割的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)在共反應(yīng)劑TPA存在下進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光均相檢測(cè)。取100 μL 100 mmol/L的 TPA(含0.10 mol/L PBS)溶液，與100 μL的 AuNPs-peptide-Ru1反應(yīng)后的清液混合后，將裸玻碳電極浸入混合液中,以掃速50 mV/s進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化(ΔI=Is-I0)定量檢測(cè)PSA，其中I0為空白信號(hào)值，Is為電化學(xué)發(fā)光探針與PSA反應(yīng)后的信號(hào)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs的TEM分析

將AuNPs膠體溶液超聲分散5 min后，再滴在碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上，待溶液揮發(fā)至干，然后在操作電壓200 kV時(shí)采用透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示合成的AuNPs為納米級(jí)，形狀為圓球狀，表面較光滑，平均粒徑約為10 nm。

2.2 AuNPs-peptide-Ru1的電化學(xué)發(fā)光性能

利用電化學(xué)線性掃描技術(shù)對(duì)AuNPs-peptide-Ru1和Ru1的電化學(xué)發(fā)光性能進(jìn)行研究(圖2)。由圖2可知，AuNPs-peptide-Ru1和Ru1均產(chǎn)生較強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，其發(fā)光峰電位分別為+1.21 V和+1.18 V，發(fā)生了微弱的偏移。表明兩者的電化學(xué)發(fā)光行為相似，所制備的AuNPs-peptide-Ru1達(dá)到了預(yù)期性能，可用作電化學(xué)發(fā)光探針。

圖2 Ru1(a)和AuNPs-peptide-Ru1(b)的電化學(xué)發(fā)光曲線Fig.2 ECL intensity-potential profiles of Ru1(a)and AuNPs-peptide-Ru1(b)concentration of Ru1 and AuNPs-peptide-Ru1 were 1.5×10-7 mol/L and 1.6 mg/mL，respectively；buffer：10 mmol/L PBS(pH 7.4)containing 0.10 mol/L TPA；scan rate：100 mV/s

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

考察了PSA與AuNPs-peptide-Ru1的反應(yīng)時(shí)間對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化值ΔI的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間由5 min增至20 min時(shí)，ΔI值急劇增加。反應(yīng)時(shí)間在20～40 min范圍內(nèi)，ΔI值增加緩慢，40 min后ΔI達(dá)到最大且保持平穩(wěn)。表明40 min足以使該體系達(dá)到平衡。因此，本實(shí)驗(yàn)的PSA識(shí)別裂解AuNPs-peptide-Ru1的反應(yīng)時(shí)間為40 min。

由于PSA是具有生物活性的絲氨酸蛋白酶，切割溫度的大小會(huì)影響其生物活性，因此實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化值ΔI的影響。結(jié)果表明，反應(yīng)溫度由5 ℃增至20 ℃時(shí)，ΔI值急劇增加；在20～30 ℃范圍內(nèi)，ΔI值增加緩慢，30 ℃時(shí)ΔI值達(dá)到最大。當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，ΔI值反而降低，表明溫度高于35 ℃時(shí)PSA的生物活性受到破壞。因此，選擇本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖3 AuNPs-peptide-Ru1與不同濃度PSA反應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度曲線Fig.3 ECL intensities vs potential profiles of AuNPs-peptide-Ru1 after reaction with different concentrations of PSA in 0.10 mol/L PBS(pH 7.4)containing 50 mmol/L TPAconcentration of PSA(a-g)：0，5.0，10，50，100，500，1 000 pg/mL；insert：calibration curve of PSA

圖4 傳感器的選擇性Fig.4 Selectivity of the biosensor 1.0×10-10 g/mL PSA and 1.0 ng/mL other proteases (MMP-2，MMP-7，trypsin and thrombin)

2.4 傳感器的分析性能

在優(yōu)化條件下，考察了AuNPs-peptide-Ru1對(duì)不同濃度PSA的檢測(cè)性能。圖3為AuNPs-peptide-Ru1與不同濃度PSA反應(yīng)前后的溶液在裸玻碳電極上恒電位積分30 s后的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度曲線。由圖可知，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨PSA濃度的增大而增強(qiáng)，且ΔI值與PSA質(zhì)量濃度在5.0×10-12～1.0×10-9g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為ΔI=1.635×106+1.377×105lgc(g/mL)，相關(guān)系數(shù)r=0.992 3，檢出限(S/N=3)為2.0×10-12g/mL。該檢出限低于文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道的檢出限(10 ng/mL和38 pg/mL)。用PSA作為標(biāo)志物診斷前列腺癌的臨界值(大于該值為異常值)為4.0 ng/mL(更多的接近2.5 ng/mL)，這說明該分析方法有望用于早期前列腺癌的診斷。

2.5 傳感器的選擇性

PSA和凝血酶、胰蛋白酶、MMP-2、MMP-7均屬于蛋白酶，因此將它們作為干擾物對(duì)傳感器的特異性進(jìn)行了考察。相同實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器對(duì)1.0×10-10g/mL PSA和1.0 ng/mL的其它蛋白酶的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)見圖4。由圖4可知，相對(duì)于其他蛋白酶，該傳感器檢測(cè)PSA的響應(yīng)信號(hào)最高。說明PSA能夠特異性地切割選用特定序列的多肽CHSSKLQK，所構(gòu)建的傳感方法具有良好的選擇性。

表1 血樣中PSA的分析結(jié)果Table 1 Analytical results of PSA in clinical serum samples

*the CL results provided by Xi'an Friendship Medical Inspection(數(shù)據(jù)來源于西安市友誼醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所)

2.6 實(shí)際樣品分析

為評(píng)估該傳感分析方法的應(yīng)用潛能，從西安市友誼醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所采集6份患者的血樣。采集的血樣經(jīng)離心后取上清液，用10 mmol/L的PBS進(jìn)行稀釋。用本文設(shè)計(jì)合成的AuNPs-peptide-Ru1測(cè)定血樣中PSA的濃度，同時(shí)與臨床采用的化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CL)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。由表1可知，本文構(gòu)建的生物傳感分析方法的測(cè)定結(jié)果與臨床CL法結(jié)果一致，表明本文建立的基于酶切割多肽的電化學(xué)發(fā)光傳感器準(zhǔn)確性良好，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本文建立了一種基于酶切割多肽探針和AuNPs離心分離均相檢測(cè)PSA的電化學(xué)發(fā)光分析新方法。該法通過在AuNPs界面上酶催化切割多肽反應(yīng)與電子傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了PSA的高靈敏檢測(cè)，減少了復(fù)雜的電極修飾過程并克服了生物傳感器重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。而且，通過簡(jiǎn)單的固液分離合成AuNPs電化學(xué)發(fā)光探針，為金納米探針的合成提供了參考。該法相比于傳統(tǒng)的免疫分析方法更簡(jiǎn)單、成本更低，改進(jìn)后可用于檢測(cè)其他具有酶切割活性的蛋白質(zhì)。