結(jié)晶葡萄糖母液對(duì)賴氨酸發(fā)酵過程的影響

，，

(長春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，吉林 長春 130062)

結(jié)晶葡萄糖母液,經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低，怎樣合理處理利用是結(jié)晶葡萄糖企業(yè)面臨的一大難題.目前，采用膜分離技術(shù)除去母液中的雜糖，不僅設(shè)備投資大，而且操作工藝復(fù)雜，難以用于大規(guī)模生產(chǎn)；而直接用于酒精、檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)則因其產(chǎn)品附加值低，成本難以控制.因此，有效地利用結(jié)晶葡萄糖母液，既能解決結(jié)晶葡萄糖的生產(chǎn)成本，又能為企業(yè)生產(chǎn)其他產(chǎn)品開發(fā)出新的原料資源.通過對(duì)結(jié)晶葡萄糖母液和L-賴氨酸發(fā)酵糖(以下簡稱發(fā)酵糖)的理化指標(biāo)進(jìn)行比較，各項(xiàng)指標(biāo)雖然存在一定的差別，但都含有大量葡萄糖，如在L-賴氨酸生產(chǎn)中用部分結(jié)晶葡萄糖母液替代發(fā)酵糖制成混合發(fā)酵糖進(jìn)行發(fā)酵，并用此和發(fā)酵糖發(fā)酵過程進(jìn)行一一對(duì)比、分析，研究混合發(fā)酵糖在產(chǎn)酸、各時(shí)段耗糖、賴氨酸增加量、糖酸轉(zhuǎn)化率以及發(fā)酵末期殘?zhí)乔闆r.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

L-賴氨酸菌，由長春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司研發(fā)中心提供.

1.1.2 原 料

結(jié)晶葡萄糖母液由長春帝豪結(jié)晶糖開發(fā)實(shí)業(yè)有限公司提供，發(fā)酵糖由長春寶成生化工程有限公司自產(chǎn).

1) 結(jié)晶葡萄糖母液

結(jié)晶葡萄糖提純采取降溫結(jié)晶工藝，淀粉乳(波美度18～20，pH 5.8～6.1)通過調(diào)漿、液化、糖化后，經(jīng)活性炭脫色、樹脂離交分離等工序凈化處理，經(jīng)四效蒸發(fā)濃縮得到精制葡萄糖(固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥69.8%、pH 3.5～4.5、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95.5%、電導(dǎo)率<50 μs/cm、透光率≥92.0%)通過攪拌降溫，形成晶漿混合體，經(jīng)過離心機(jī)分離出晶體后的剩余部分成為結(jié)晶葡萄糖母液[1]，母液除了含有糖，還有灰分、蛋白質(zhì)和羥甲基糠醛等雜質(zhì)，見表1.糖分由葡萄糖、二糖和多糖組成，見表2[2].

表1 結(jié)晶葡萄糖母液的化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of crystalline glucose mother liquor

表2結(jié)晶葡萄糖母液中糖分的組成

Table2Thecompositionofsugarincrystallineglucosemotherliquor

糖分組成質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%葡萄糖54.5～55.5二糖25.5多糖6.5～7.5

一次結(jié)晶葡萄糖母液經(jīng)四效蒸發(fā)濃縮后，固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)63%；葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90.0%；pH≥3.5.

2) 賴氨酸發(fā)酵糖(以下簡稱發(fā)酵糖)

淀粉乳(波美度18～20，pH 5.8～6.1)經(jīng)調(diào)漿，在α-淀粉酶作用下將淀粉乳液化，經(jīng)過液化的混合液直接加入糖化酶進(jìn)入糖化階段，液化過程中除了加淀粉酶還要加氯化鈣，pH 6.0～6.2，噴射溫度106～108 ℃，特別注意糊化時(shí)間不少于3 min，碘試為棕紅色為宜，不能液化過頭[3]，降溫至95～98 ℃維持1.5～2 h；淀粉乳液化后，通過冷卻器降溫至60 ℃進(jìn)入糖化罐，加入糖化酶進(jìn)行糖化.糖化溫度控制在60 ℃左右，pH 4.5，糖化周期30～35 h，對(duì)發(fā)酵水平最合適糖化周期過長或過短，均可造成糖化副反應(yīng)的增加[4].經(jīng)液化、糖化(DE值≥97.0%，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95.0%)，不經(jīng)活性炭脫色、樹脂離子交換直接經(jīng)真空轉(zhuǎn)鼓過濾粗蛋白，再蒸發(fā)濃縮至(固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)59%～61%)，見表3.

表3 發(fā)酵糖的化學(xué)組成Table 3 The chemical composition of fermented sugar

1.2 方 法

1.2.1 混合發(fā)酵糖的配制

以20%結(jié)晶葡萄糖母液和80%發(fā)酵糖混合形成的混合發(fā)酵糖.

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

MgSO40.136 g/dL, KCl 0.027 g/dL,甜菜堿0.182 g/dL,泡敵0.005 g/dL, H3PO40.009 6 g/dL,糖71.06 g/dL,生物素0.000 05 g/dL,蘇氨酸0.91%(體積分?jǐn)?shù))，玉米漿1.82%(體積分?jǐn)?shù)).

發(fā)酵罐體積500 m3，最大裝液量270 m3，按接種量10%，使用風(fēng)量120～180 m3/min，pH 6.8～7.0,罐壓1.0～1.2 kg/cm2，培養(yǎng)溫度36～37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間51 h.

1.2.3 補(bǔ)糖方法

糖71.06 g/dL，經(jīng)過110 ℃連消滅菌，降溫至60～70 ℃到達(dá)封閉儲(chǔ)罐中，保壓2.5～2.6 kg/cm2.

1.2.4 分析方法

賴氨酸測(cè)定方法:茚三酮顯色法.

糖的檢測(cè)方法:斐林試劑法.

pH測(cè)定:pH電極法.

2 結(jié)果與分析

L-賴氨酸生產(chǎn)中，發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基或發(fā)酵過程中間補(bǔ)加混合發(fā)酵糖，跟以發(fā)酵糖配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基或發(fā)酵過程中間補(bǔ)加發(fā)酵糖發(fā)酵進(jìn)行對(duì)比，每種糖發(fā)酵任意抽取10個(gè)罐批次，在各時(shí)間段L-賴氨酸的產(chǎn)生量、發(fā)酵中間過程補(bǔ)糖量、賴氨酸增加量、糖酸轉(zhuǎn)化率以及發(fā)酵末期殘?zhí)沁M(jìn)行比較.

采用連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式進(jìn)行對(duì)比，連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵是低濃度發(fā)酵，即發(fā)酵培養(yǎng)基初糖分濃度較低，這樣就解除了基質(zhì)濃度過高而形成的阻遏效應(yīng)，避免了由于代謝產(chǎn)物積累過度而形成的反饋抑制作用[5]，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后，連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，每隔一段時(shí)間排放出一定體積的發(fā)酵液，這樣適時(shí)合理地調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)濃度解決了阻遏效應(yīng)[6]，發(fā)酵過程中發(fā)酵液體積在不影響攪拌和泡沫可控的情況下，保證發(fā)酵罐內(nèi)物料糖分及其它營養(yǎng)成分滿足菌種的需要.

2.1 發(fā)酵過程中各時(shí)間段賴氨酸產(chǎn)酸情況比較

在同一發(fā)酵工藝，即相同菌種、使用風(fēng)量、pH、壓力和溫度的情況下，兩種糖在配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)加糖濃度上相同，發(fā)酵方式是連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為51 h，每間隔3 h檢測(cè)罐內(nèi)料液糖分、OD值(透光率)的變化，在保證發(fā)酵罐內(nèi)糖分1.0 g/dL左右，向罐內(nèi)補(bǔ)加糖、硫酸銨和總氮等營養(yǎng)基質(zhì)，發(fā)酵罐內(nèi)物料體積不斷增加；發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，每間隔6 h對(duì)發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液取樣檢測(cè)；發(fā)酵后期由于菌種進(jìn)入衰退期，監(jiān)測(cè)頻率增加,每間隔3 h對(duì)發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液賴氨酸含量進(jìn)行檢測(cè)；發(fā)酵48 h后，補(bǔ)料和連續(xù)放料基本結(jié)束.48 h和51 h視為最后放罐樣，取一個(gè)檢測(cè)樣，測(cè)賴氨酸含量，其他糖檢測(cè)和糖酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算都是按這個(gè)時(shí)間段標(biāo)注，根據(jù)發(fā)酵罐內(nèi)料液的體積及產(chǎn)酸情況，采用間接式或連續(xù)式放料的方法，保證發(fā)酵罐內(nèi)體積不影響攪拌和泡沫可控，每種糖發(fā)酵各抽取10個(gè)批次，對(duì)10個(gè)罐批次不同發(fā)酵時(shí)間段(12,18,24,30,42,45,51 h)的L-賴氨酸質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，見圖1.

圖1 發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸的變化曲線對(duì)比Fig.1 Comparison of the variation curves of acid in fermentation process between fermented sugar and mixed fermented sugar

在發(fā)酵末期產(chǎn)酸，混合發(fā)酵糖為16.17 g/dL，發(fā)酵糖為17.19 g/dL，低1.02 g/dL.

2.2 發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖發(fā)酵各時(shí)間段補(bǔ)加糖量對(duì)比

賴氨酸發(fā)酵是微生物經(jīng)過一個(gè)復(fù)雜生長的過程，賴氨酸菌種不斷攝取原料的營養(yǎng)，消耗碳源、氮源，發(fā)酵罐不斷補(bǔ)加糖、硫酸銨和總氮等以維持菌種的營養(yǎng)需求，達(dá)到多產(chǎn)酸的目的.在發(fā)酵過程中每間隔3 h取樣檢測(cè)罐內(nèi)發(fā)酵液糖分含量，在保證發(fā)酵罐內(nèi)菌種用糖的情況下，向罐內(nèi)補(bǔ)加糖，見圖2(發(fā)酵12 h后，間隔6 h；發(fā)酵42 h后間隔3 h各時(shí)段的耗糖量).

圖2 發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖各發(fā)酵時(shí)段的糖補(bǔ)加量曲線對(duì)比Fig.2 Comparison of sugar supplementation curves between fermented sugar and mixed fermented sugar

2.3 發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖發(fā)酵各時(shí)間段賴氨酸增加量對(duì)比

根據(jù)賴氨酸連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵菌種的生化代謝特點(diǎn)，在發(fā)酵過程中加入一定量的生物素，在生物素限量的情況下，由于菌體細(xì)胞合成不完整，谷氨酸能夠從細(xì)胞內(nèi)滲透到細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)谷氨酸含量降低，谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶的反饋控制失控，谷氨酸不斷被優(yōu)先合成[7]，這一現(xiàn)象同樣在賴氨酸生化反應(yīng)中表現(xiàn)出來，發(fā)酵培養(yǎng)過程中，不同時(shí)間段賴氨酸菌種產(chǎn)酸量不同，發(fā)酵12 h后，每6 h檢測(cè)一次發(fā)酵罐內(nèi)賴氨酸含量，計(jì)算12,18,24,30,42,45,51 h各時(shí)間段賴氨酸增加量，結(jié)果見圖3.

圖3 發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖在各發(fā)酵時(shí)間段賴氨酸的增加量曲線對(duì)比Fig.3 Comparison curve of the increase of lysine between fermented sugar and mixed fermented sugar

2.4 發(fā)酵過程中發(fā)酵罐補(bǔ)料總體積、連續(xù)放料體積及糖酸轉(zhuǎn)化率的比較

在連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵中，發(fā)酵罐進(jìn)料定容體積+種子接種量體積=發(fā)酵罐初始發(fā)酵體積.

向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加糖、硫酸銨和總氮等，發(fā)酵罐內(nèi)料液體積不斷增加，液位不斷升高，產(chǎn)生的泡沫已經(jīng)無法通過添加消泡劑除掉，對(duì)發(fā)酵罐的攪拌動(dòng)力系統(tǒng)產(chǎn)生極大的威脅，發(fā)酵初糖和補(bǔ)加糖的總體積占發(fā)酵液的總體積的60%，其質(zhì)量對(duì)發(fā)酵液的產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率影響很大[8]，需要定期從發(fā)酵罐底部排除部分發(fā)酵液，以保證發(fā)酵罐繼續(xù)工作，維持一個(gè)發(fā)酵周期結(jié)束.采用連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法，由于基質(zhì)的不斷補(bǔ)入，既滿足了微生物生長和產(chǎn)物合成的需要，又避免了由于基質(zhì)過量引起的各種調(diào)控反應(yīng)，從而使產(chǎn)率獲得很大提高.通過少次多量—少量多次—補(bǔ)加—微機(jī)控制流加，整個(gè)發(fā)酵過程中不斷地調(diào)節(jié)補(bǔ)料，維持各項(xiàng)營養(yǎng)物質(zhì)的供需平衡，保證發(fā)酵罐內(nèi)總體積小于270 m3.發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖補(bǔ)料總體積及連續(xù)放料體積對(duì)比，見表4.

表4 發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖補(bǔ)料總體積及連續(xù)放料體積對(duì)比表

發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖各時(shí)間段糖酸轉(zhuǎn)化率(只計(jì)算發(fā)酵罐糖酸轉(zhuǎn)化率,相對(duì)應(yīng)的種子罐耗糖沒有計(jì)算在內(nèi))，見表5.

表5 發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖各時(shí)間段糖酸轉(zhuǎn)化率對(duì)比表

混合發(fā)酵糖對(duì)應(yīng)賴氨酸轉(zhuǎn)化率58.71%，與之相應(yīng)的單耗為

1/58.71%/63%=2.70 t

發(fā)酵糖對(duì)應(yīng)賴氨酸轉(zhuǎn)化率62.56%，與之相應(yīng)的單耗為

1/62.56%/63%=2.54 t

可見，每噸L-賴氨酸，混合發(fā)酵糖比發(fā)酵糖多消耗0.16 t.

2.5 發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖各批次總放罐體積及殘余糖分對(duì)比

每個(gè)批次總放罐體積=發(fā)酵結(jié)束后放罐體積+連續(xù)放料體積.

每種糖發(fā)酵的10個(gè)批次的發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)束后，總放罐體積及殘余糖分?jǐn)?shù)值，見表6.

表6發(fā)酵糖和混合發(fā)酵糖各批次總放罐體積及殘余糖分對(duì)比表

Table6Comparisontableoftotalvolumeandresidualsugaroffermentationsugarandmixedfermentationsugarineachbatch

批次發(fā)酵糖總體積/m3殘?zhí)?(g·dL-1)混合發(fā)酵糖總體積/m3殘?zhí)?(g·dL-1)14170.344040.8624140.413900.8633250.323800.7943830.453610.8354250.323850.6763810.323250.8673990.424120.8383550.853500.4894180.443950.61103600.384051.02平均387.70.433810.78

發(fā)酵末期混合發(fā)酵糖發(fā)酵殘?zhí)欠?.78 g/dL高于發(fā)酵糖殘?zhí)?.43 g/dL，高81.4%.

發(fā)酵糖發(fā)酵末期500 m3發(fā)酵罐內(nèi)殘?zhí)菫?/p>

387.7×104(dL)×0.43(g/dL)/106=1.67 t

混合發(fā)酵糖發(fā)酵末期500 m3發(fā)酵罐內(nèi)殘?zhí)菫?/p>

381×104(dL)×0.78(g/dL)/106=2.97 t

可見,每個(gè)發(fā)酵周期，混合發(fā)酵糖發(fā)酵要比發(fā)酵糖發(fā)酵損失糖1.3 t.

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加糖相同濃度，采用混合糖發(fā)酵，產(chǎn)品質(zhì)量都能達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，混合發(fā)酵糖發(fā)酵無論在各時(shí)間段產(chǎn)酸量、耗糖量、賴氨酸增加量以及糖酸轉(zhuǎn)化率上都比用發(fā)酵糖直接發(fā)酵略低，最終也會(huì)使混合發(fā)酵糖發(fā)酵殘余糖分高于純發(fā)酵糖，發(fā)酵后期殘余糖分要高81.4%.

3 結(jié) 論

以20%結(jié)晶葡萄糖母液和80%發(fā)酵糖混合形成的混合發(fā)酵糖進(jìn)行賴氨酸發(fā)酵，跟發(fā)酵糖直接用于賴氨酸發(fā)酵相比，無論在各時(shí)間段產(chǎn)酸、糖的補(bǔ)加量、賴氨酸增長量、糖酸轉(zhuǎn)化率和殘?zhí)嵌加兴兓谕痪N，同一培養(yǎng)基的情況下，這一變化并沒有實(shí)質(zhì)上的不同.因此，從發(fā)酵控制工藝上看，以混合糖發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸是完全可行的.谷氨酸棒桿菌，不但能夠利用淀粉水解中的葡萄糖，糖蜜中的蔗糖和果糖，還能利用麥芽糖和核糖進(jìn)行發(fā)酵[9]，同屬于棒桿菌的賴氨酸菌種也具有這一特點(diǎn)，但在發(fā)酵末期這部分不能為賴氨酸菌種所利用的糖,是殘留于母液中的還原性物質(zhì)，這部分物質(zhì)使殘?zhí)巧遊10].從表面上看提高了L-賴氨酸的生產(chǎn)成本，而結(jié)晶葡萄糖母液的充分利用，大大降低了結(jié)晶葡萄糖的生產(chǎn)成本，如果母液不加以利用，不僅污染環(huán)境，而且使生產(chǎn)造成極大的浪費(fèi).因此，從經(jīng)濟(jì)與環(huán)保角度考慮，結(jié)晶葡萄糖生產(chǎn)和L-賴氨酸生產(chǎn)有效協(xié)調(diào)、配合,是集約式綜合利用，使生產(chǎn)向深度和廣度發(fā)展的大勢(shì)所趨，為結(jié)晶葡萄糖和L-賴氨酸生產(chǎn)開拓了廣闊的發(fā)展前景.