墨蘭與大花蕙蘭雜交育種研究

李玉萍，吳春雷，王燕青，羅鳳霞

(1.金陵科技學(xué)院園藝學(xué)院，江蘇南京210038;2.南京市中山陵園管理局，江蘇南京21001)

墨蘭(Cymbidium sinense)別稱報(bào)歲蘭，蘭科蘭屬多年生草本，原產(chǎn)我國(guó)、越南和緬甸。葉片劍形，深綠色，具光澤;花莖通常高出葉面，在野生狀態(tài)下可達(dá)80～100 cm，有花7～17朵，萼片披針形，淡褐色，有5條紫褐色的脈，花瓣短寬，唇瓣三裂不明顯，先端下垂反卷。花期1—3月，品種甚多，少數(shù)在秋季開花［1－2］。

大花蕙蘭(C.grandiflorum)別稱西姆比蘭、虎頭蘭，系指原產(chǎn)于喜馬拉雅山、印度、緬甸、泰國(guó)等地蕙蘭的大型花原種以及以它為基礎(chǔ)雜交而得到的品種，具有植株強(qiáng)健、花大花多、花色艷麗、花期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)［3－4］，是世界上栽培最普及的蘭花之一，享有“蘭花皇后”的美譽(yù)［3］。尤其是當(dāng)代的大花蕙蘭品種，都是經(jīng)過多代雜交選育出的優(yōu)良品種。與原種比較，花型規(guī)整，花瓣寬，花朵優(yōu)美，色彩艷麗而豐富，花莖直立而挺拔，花朵數(shù)目多且排列緊密，深受國(guó)內(nèi)外蘭花愛好者的歡迎，具有較大的市場(chǎng)潛力。但大花蕙蘭在自然狀態(tài)下繁殖困難，種子萌發(fā)率極低，僅為5%左右，且大花蕙蘭傳統(tǒng)分株繁殖周期長(zhǎng)，效率低［5］，難以滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。

大花蕙蘭與墨蘭分別以花大色艷、生長(zhǎng)健壯與多花芳香等優(yōu)良性狀而深受世界各地人們的歡迎，但目前，國(guó)內(nèi)蘭花市場(chǎng)上的蘭花品種大都受到蘭花產(chǎn)地以及蘭花生態(tài)習(xí)性等的限制，從而無法達(dá)到人們的觀賞性要求，同時(shí)也給一些蘭花優(yōu)良品種的推廣帶來了極大的難度。曾碧玉等都曾報(bào)道過大花蕙蘭與墨蘭之間的雜交試驗(yàn)，但結(jié)實(shí)率相對(duì)都較低，且不同品種間雜交結(jié)實(shí)率相差較大，正交與反交結(jié)實(shí)率也有一定差異［6－7］。

本試驗(yàn)以3個(gè)墨蘭品種及3個(gè)大花蕙蘭品種為親本進(jìn)行雜交，在研究親本生物學(xué)特性的同時(shí)，對(duì)其花粉活性、人工雜交授粉特性和雜種胚的發(fā)育過程等進(jìn)行研究，以期能夠結(jié)合大花蕙蘭與墨蘭的優(yōu)良性狀，創(chuàng)造出開花數(shù)量多、兼具國(guó)蘭香氣同時(shí)抗性強(qiáng)的蘭花新品種，并為今后培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蘭花新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)園藝學(xué)院2014年12月引種的盆栽中國(guó)蘭為材料，具體品種名稱及特性為:富貴(墨蘭)，花深紅褐色，芳香，水仙瓣型;白墨(墨蘭)，花黃綠色，芳香，素心瓣型;閩南大梅(墨蘭)，花深紅色，芳香，水仙瓣型;黃金大富貴(大花蕙蘭)，花黃色，直立中花型;黃金歲月(大花蕙蘭)，花黃色，直立中花型;綠GZ(大花蕙蘭)，花綠色，淡香，直立大花型。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉活力測(cè)定 采用雙凹槽載玻片懸滴法進(jìn)行花粉離體培養(yǎng)。2015年3月以盛花期08:30—10:30采集的白墨花粉為材料，根據(jù)郭麗霞等養(yǎng)基配方經(jīng)改良設(shè)計(jì)了 L9(34)正交試驗(yàn)［8］(表1)?；ǚ鄄苫睾笕∵m量放在潔凈的載玻片凹槽內(nèi)，滴加蒸餾水浸泡，待花粉塊吸水膨脹變成黃白色時(shí)，用鑷子輕夾，直至花粉塊變成糊狀。之后將預(yù)先配制好的培養(yǎng)液滴于雙凹槽載玻片上，用鑷子輕攪，使花粉分散懸浮在培養(yǎng)液滴內(nèi)。再將制好的載玻片放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋上蓋子，在25℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后開始鏡檢，以后每隔4 h鏡檢1次，直至花粉管數(shù)目基本穩(wěn)定時(shí)統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)觀察不少于100粒的花粉。當(dāng)花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒直徑的2倍時(shí)，計(jì)為萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)率 =(萌發(fā)的花粉數(shù)/鏡檢的花粉總數(shù))×100%。在得出適宜培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上采集其他品種的花粉，進(jìn)行花粉生活力測(cè)定。

1.2.2 雜交親和性 以墨蘭3個(gè)品種為母本分別與大花蕙蘭3個(gè)品種進(jìn)行雜交，探討各組合間的雜交親和性。待母本花葶伸出，花朵開放前先行除蕾:選擇保留花葶中部偏下3～4朵花蕾，其余全部摘除。小花盛開時(shí)授粉，因蘭花蕊腔開口朝下且分泌有黏液，授粉后花粉塊會(huì)牢牢粘在蕊腔中，不須套袋，去除唇瓣即可。授粉后加強(qiáng)肥水管理，病蟲害防治并定期觀察果實(shí)發(fā)育狀況，30 d后統(tǒng)計(jì)子房膨大數(shù)，120 d后統(tǒng)計(jì)果實(shí)數(shù)量，并分別計(jì)算子房膨大率和結(jié)實(shí)率。

表1 花粉生活力測(cè)定液體培養(yǎng)基配方

1.2.3 雜交幼胚離體培養(yǎng) 以雜交組合獲得的3個(gè)月以上未開裂的黃綠色果實(shí)為材料。流水沖洗后，先用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗 2～3次，再用 0.1%氯化汞浸泡20 min，無菌水沖洗3次。滅菌后將果實(shí)切開，將幼胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，每個(gè)組合每個(gè)處理至少接種3瓶。培養(yǎng)基設(shè)計(jì)3 種，分別為:1 號(hào)，1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L 6 －BA+2 g/L AC;2 號(hào)，1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L 6 －BA+2 g/L 蛋白胨 +2 g/L AC;3 號(hào)，1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L 6－BA+100 mg/L 谷氨酰胺 +2 g/L AC。

以上培養(yǎng)基各加入20 g/L蔗糖和7.5 g/L瓊脂，pH值5.4，在121℃條件下滅菌25 min。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照14 h/d，光照度2 000 lx。接種后60 d開始，每周觀察統(tǒng)計(jì)雜交種子萌發(fā)情況。所有試驗(yàn)均在金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。150 g/L時(shí)，花粉萌發(fā)率明顯降低，平均萌發(fā)率降至8.47%，培養(yǎng)基8號(hào)花粉萌發(fā)率僅為4.5%，這可能是高含量的蔗糖溶液引起了花粉質(zhì)壁分離從而降低了花粉活力。對(duì)白墨花粉萌發(fā)率影響次之的是氯化鈣含量，含量為10 mg/L時(shí)花粉萌發(fā)最好，平均萌發(fā)率為43.73%。硼酸含量與GA3含量與花粉萌發(fā)影響較小，硼酸含量為5 mg/L，花粉萌發(fā)率最高，平均為39.70%;GA3各含量對(duì)花粉萌發(fā)的影響不明顯，極差僅為1.6%。綜合分析，白墨(墨蘭)花粉萌發(fā)適宜培養(yǎng)基為5號(hào)，即100 g/L蔗糖+5 mg/L硼酸+10 mg/L CaCl2+10 mg/L GA3。

表2 白墨花粉萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)及極差分析

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力

蘭屬植物花粉不開散，是由許多四分體花粉聚合而成的，扁圓形的、兩大兩小的4個(gè)花粉塊。大花蕙蘭和墨蘭當(dāng)天開放花朵花粉均為鮮艷的黃色，隨著開放時(shí)間的增加，花粉塊失水顏色逐漸加深，約1周后變?yōu)楹稚?，完全失水成硬塊，無法碾碎，并失去黏性。在顯微鏡下觀察，新鮮花粉呈四合體狀，花粉萌發(fā)時(shí)，一般四合體的每一個(gè)花粉小孢子都可以長(zhǎng)出花粉管，但并非所有四合體均能萌發(fā)4個(gè)花粉管，有的花粉細(xì)胞發(fā)生不同程度的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(表2)。

由表2可知，在不同培養(yǎng)基上花粉的萌發(fā)率不同，在4個(gè)影響因子中，蔗糖含量對(duì)白墨花粉萌發(fā)的影響最大，當(dāng)蔗糖含量為100 g/L時(shí)，花粉萌發(fā)率最高，平均達(dá)到52.07%，其中培養(yǎng)基5號(hào)花粉萌發(fā)率達(dá)到了60.3%。蔗糖含量增高到

在選定花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基基礎(chǔ)上采集其他品種花粉進(jìn)行測(cè)定，閩南大梅、富貴、黃金歲月、黃金大富貴、綠GZ的花粉萌發(fā)率分別為 51.2%、56.4%、21.0%、19.5%、20.4%。由此可知，該培養(yǎng)基比較適合墨蘭3個(gè)品種的花粉萌發(fā)，花粉萌發(fā)率均高于50%。3個(gè)大花蕙蘭品種花粉在該培養(yǎng)基上都有萌發(fā)，萌發(fā)率也較接近，約20%，在雜交育種時(shí)可作為父本授粉。

2.2 雜交親和性

大花蕙蘭開花后1周內(nèi)花粉具有較高的活力，可以進(jìn)行人工授粉，但以開花后1～3 d的花粉受精情況最好。授粉后3個(gè)墨蘭品種的花瓣在1周后即發(fā)生萎蔫。人工授粉后，子房在花粉的刺激下，大都會(huì)有不同程度的膨大，但授粉后柱頭和子房的膨大并不意味著受精的完成。子房膨大后1個(gè)月內(nèi)不斷有較小的果實(shí)黃化脫落，直至授粉后3個(gè)月，仍會(huì)有果實(shí)變黃逐漸脫落現(xiàn)象發(fā)生(表3)。

由表3可知，9個(gè)雜交組合子房雖都有膨大，但在發(fā)育后期除3個(gè)組合有果實(shí)保留下來，其余均脫落，這可能與遠(yuǎn)緣雜交存在受精后障礙有關(guān)。在獲得果實(shí)的3個(gè)組合中，閩南大梅×黃金歲月授粉40朵，僅獲得1個(gè)果實(shí)，坐果率為2.5%;白墨×黃金歲月坐果率為18.4%;白墨×黃金大富貴坐果率為23.3%。結(jié)果說明墨蘭3個(gè)品種與大花蕙蘭3個(gè)品種間的親和性較低。

表3 各雜交組合人工授粉結(jié)果情況

雜交親和性的高低與親本的遺傳背景有關(guān)，各親本的染色體倍數(shù)相近，雜交親和力高，雜交結(jié)果相應(yīng)就高。大花蕙蘭在其育種歷程中，不斷有不同程度的染色體加倍現(xiàn)象出現(xiàn)，使其倍性復(fù)雜化，有二倍體，也有三倍體或四倍體，但以三倍體居多;而墨蘭大多為二倍體［9］。倍性不同的父母本雜交時(shí)受精情況不良、合子胚的發(fā)育不正常、正常胚的數(shù)量很少等均會(huì)導(dǎo)致果實(shí)敗育。此外，倍性差異引起無法形成正常配子及存在的生殖隔離也會(huì)對(duì)雜交果實(shí)的發(fā)育產(chǎn)生很大影響。

雜交授粉后出現(xiàn)的落果嚴(yán)重現(xiàn)象，可能與蘭屬植物的胚胎生物學(xué)特性有關(guān)，沒有完成雙受精是造成這種現(xiàn)象的主要原因。因?yàn)樘m花授粉后，蘭屬的孢原細(xì)胞直接行使大孢子母細(xì)胞的功能，這段時(shí)間即開始表現(xiàn)子房的膨大，但受精過程并沒有進(jìn)行?；ǚ墼谥^上42 h以后才會(huì)萌發(fā)花粉管，花粉管的伸長(zhǎng)也比較緩慢，40～45 d以后才可以到達(dá)胚珠。

2.3 雜交幼胚胚離體培養(yǎng)

將雜交后100～120 d的雜交幼胚經(jīng)無菌播種到3種培養(yǎng)基上，種胚在培養(yǎng)60 d后逐漸開始萌發(fā)，先由白色逐漸變成褐色和部分小綠點(diǎn)，后逐漸轉(zhuǎn)綠，體積增大，形成肉眼可見的原球莖。各雜交組合在不同培養(yǎng)基的萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間與萌發(fā)情況不盡相同，培養(yǎng)180 d后統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率，因種子仍呈團(tuán)塊狀未完全散開，難以計(jì)算其萌發(fā)率，僅以接種數(shù)和萌發(fā)數(shù)情況來計(jì)(表4)。

表4 雜交幼胚在各培養(yǎng)基上的萌發(fā)狀況

由表4可知，不同雜交組合幼胚在各培養(yǎng)基上的萌發(fā)率不同。3個(gè)雜交組合中除閩南大梅×黃金歲月在1號(hào)培養(yǎng)基上沒有萌發(fā)，在其他培養(yǎng)基上都有萌發(fā)。在2號(hào)培養(yǎng)基上均有萌發(fā)良好，平均萌發(fā)率為69.31%，其中白墨×黃金大富貴雜交幼胚萌發(fā)率達(dá)到85.71%;其次是3號(hào)培養(yǎng)基，3個(gè)組合幼胚平均萌發(fā)率達(dá)到37.56%。由此可知，在培養(yǎng)基中添加有機(jī)物有利于蘭屬雜交幼胚的萌發(fā)，尤其是蛋白胨促進(jìn)了胚的萌發(fā)。

3 結(jié)論與討論

花粉離體液體萌發(fā)法是測(cè)定蘭花花粉生活力的有效手段，但培養(yǎng)基的不同組分對(duì)花粉生活力的影響有差異。蔗糖含量對(duì)白墨花粉萌發(fā)的影響最大，其次是硼酸含量。蔗糖含量以100 g/L為佳，含量過高會(huì)抑制花粉的萌發(fā)，這與郭麗霞等的研究結(jié)果［8］一致。蔗糖在花粉萌發(fā)中除了提供能源外，還起著調(diào)節(jié)花粉細(xì)胞與培養(yǎng)液之間滲透壓的作用。蔗糖含量過低會(huì)造成花粉細(xì)胞破裂，原生質(zhì)外流;含量過高，則易導(dǎo)致花粉細(xì)胞原生質(zhì)體脫水而質(zhì)壁分離，從而抑制花粉萌發(fā)。在一定范圍內(nèi)，B3+、Ca2+、GA3含量均對(duì)蘭花花粉的萌發(fā)有一定促進(jìn)作用，三者中以B3+含量影響最大。張義等發(fā)現(xiàn)，GA3可促進(jìn)花粉萌發(fā)［10－11］，本試驗(yàn)也得到了同樣結(jié)論。

墨蘭和大花蕙蘭不同品種的花粉生活力不同，墨蘭3個(gè)品種的花粉生活力均高于大花蕙蘭，即白墨(603.%)＞富貴(56.4%) ＞閩南大梅(51.2%);黃金歲月(21.0%) ＞ 綠 GZ(20.4%) ＞ 黃金大富貴(19.5%)，這與凌春英的研究結(jié)果［9］一致。因此，在進(jìn)行雜交育種時(shí)，應(yīng)盡可能選擇花粉活力高的品種作為父本，從而在一定程度上提高結(jié)果率。本試驗(yàn)僅開展了以墨蘭為母本的雜交，以墨蘭各品種為父本能否提高雜交結(jié)實(shí)率還須要進(jìn)一步探討。

以墨蘭為母本，大花蕙蘭為父本的9個(gè)雜交組合雖子房均有膨大，但只有3個(gè)組合獲得了雜交胚，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是所選品種的育性不同，且品種間親和力也有所差異;此外，栽培管理及氣候條件也有一定的影響［6］。在6個(gè)品種中白墨作母本有2個(gè)組合獲得了雜交胚，黃金歲月作父本有2個(gè)組合獲得了雜交胚。即墨蘭3個(gè)品種中白墨更適合作母本，大花蕙蘭黃金歲月更適合作父本。

授粉后絕大多數(shù)子房都有不同程度的膨大，但是果實(shí)發(fā)育過程中存在早期敗育問題，這種子房的膨大是由于花粉均已萌發(fā)花粉管伸長(zhǎng)到子房中引起的正常生長(zhǎng)發(fā)育膨大，還是由于人工授粉的刺激導(dǎo)致的內(nèi)部激素的反應(yīng)，從而導(dǎo)致子房膨大，這有待進(jìn)一步深入研究。

種子的萌發(fā)與否與種子的成熟度密切相關(guān)，但有關(guān)種子成熟度與萌發(fā)率的關(guān)系許多研究結(jié)果并不一致。國(guó)蘭種子的采收時(shí)期因不同組合而異，主要是觀察蒴果外觀變化，果皮的光澤度降低且微微泛黃時(shí)采收為佳，以130～190 d萌發(fā)效果較好。

培養(yǎng)基是蘭花雜交育種過程中雜種胚拯救和初期生長(zhǎng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)蘭花雜交幼胚無菌萌發(fā)起關(guān)鍵性作用。在培養(yǎng)基中添加一定的有機(jī)物可以促進(jìn)蘭花雜交幼胚的萌發(fā)，在添加蛋白胨的培養(yǎng)基上3個(gè)組合的雜交幼胚均有較好的萌發(fā)，平均萌發(fā)率達(dá)到了69.31%，其中白墨×黃金大富貴雜交幼胚萌發(fā)率達(dá)到85.71%，此外萌發(fā)的原球莖長(zhǎng)勢(shì)好，這與曾宋君等的研究結(jié)果［12－13］一致。培養(yǎng)基 1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L 6－BA+2 g/L蛋白胨+2 g/L AC更適于3個(gè)雜交組合幼胚的無菌萌發(fā)。