碳、氮源對(duì)猴頭菌菌絲和子實(shí)體生長(zhǎng)及胞外酶的影響

范博文，龔教龍，林俊俊，趙 瑩，石新新，唐春雙，王智慧，李佐同，楊克軍，趙長(zhǎng)江

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶163319)

猴頭菌(Hericium erinaceus)是我國(guó)珍貴的食藥兼用真菌［1］，屬于猴菇目猴菇科猴菇屬［2］。猴頭菌味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“山珍猴頭、海味燕窩”之稱。近幾年，隨著市場(chǎng)需求的增大，人們對(duì)猴頭菌的研究也不斷加大。但研究主要集中在栽培技術(shù)方面，對(duì)猴頭菌的生理特性研究較少，且不具有系統(tǒng)性。趙占國(guó)等認(rèn)為猴頭菌菌絲生長(zhǎng)最適宜的碳源為葡萄糖和甘露糖，麥芽糖、淀粉、乳糖等次之［3］。石勇民等認(rèn)為猴頭菇菌絲在蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基中干質(zhì)量最大，酵母膏次之，并且對(duì)于有機(jī)氮的利用效果強(qiáng)于無(wú)機(jī)氮［4］。何錦星通過(guò)利用棉籽殼和酒渣2種不同培養(yǎng)料栽培猴頭菌，將所得到的兩種子實(shí)體與野生猴頭菌子實(shí)體進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)三者品質(zhì)都不同，表明了不同營(yíng)養(yǎng)對(duì)猴頭菌子實(shí)體品質(zhì)有一定影響［5］。目前，對(duì)猴頭菌所需不同種類碳、氮源的研究主要集中在菌絲期，原因是按照傳統(tǒng)方法單一碳、氮源固體培養(yǎng)很難形成子實(shí)體，而吳政聲用液體培養(yǎng)在9種食用菌中做出菇試驗(yàn)，成功形成子實(shí)體［6］。將液體培養(yǎng)與探究碳、氮源對(duì)猴頭菌營(yíng)養(yǎng)利用相結(jié)合，能更深一步了解不同營(yíng)養(yǎng)對(duì)猴頭菌理化性質(zhì)的影響。本試驗(yàn)通過(guò)探究不同碳、氮源對(duì)猴頭菌菌絲和子實(shí)體生長(zhǎng)以及胞外酶的影響，為猴頭菌營(yíng)養(yǎng)利用規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

猴頭菌(Hericium erinaceus)菌株RT22由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院提供。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基):蛋白胨2.0 g，葡萄糖 20.0 g，磷酸氫二鉀 1.0 g，硫酸鎂 0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，維生素 B10.5 g，瓊脂 20.0 g，水 1 000.0 mL。

碳源固體培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖分別用供試碳源(麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、纖維素、果糖)替代，供試碳源濃度為20 g/L。

碳源液體培養(yǎng)基:去掉固體培養(yǎng)基配方中瓊脂，并將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖分別用供試碳源(麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、纖維素、果糖)替代。供試碳源濃度為20 g/L。

氮源固體培養(yǎng)基:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨分別用供試氮源(苯丙氨酸、谷氨酰胺、硝酸銨、尿素、蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉)替代，供試氮源濃度為2 g/L。

氮源液體培養(yǎng)基:去掉固體培養(yǎng)基配方中瓊脂，并將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨分別用供試氮源(苯丙氨酸、谷氨酰胺、硝酸銨、尿素、蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉)替代，供試氮源濃度為2 g/L。

1.3 猴頭菌生長(zhǎng)試驗(yàn)

1.3.1 猴頭菌菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn) 菌種活化后，取直徑5 mm的菌種塊，接種到固體培養(yǎng)基上，溫度25℃避光培養(yǎng)，之后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)指標(biāo)。試驗(yàn)均采用直徑90 mm的培養(yǎng)皿，其中培養(yǎng)基用量20 mL/皿。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.2 猴頭菌子實(shí)體原基生長(zhǎng)試驗(yàn) 菌種活化后，取直徑5 mm的菌種塊，接種到液體培養(yǎng)基中(每瓶接種10個(gè)菌種塊)，溫度25℃避光培養(yǎng)20 d后，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)指標(biāo)。菌絲移入溫度18℃、光照800～1 000 lx條件下出菇。出菇期第25天(此時(shí)形成子實(shí)體處理中九成達(dá)到要求)收集子實(shí)體原基，測(cè)定其品質(zhì);吸取培養(yǎng)液，8 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液測(cè)定其酶活性。每個(gè)處理3次重復(fù)。1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 固體培養(yǎng)第15天測(cè)菌絲生長(zhǎng)速度，固體和液體培養(yǎng)第20天，取菌絲(固體菌絲用刀片刮下)80℃ 烘干至恒質(zhì)量，稱取干重。

1.4.2 子實(shí)體原基品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.4.2.1 還原糖含量測(cè)定 取3 g樣品，加入50 mL蒸餾水，置于50℃恒溫水浴中保溫20 min，使還原糖浸出，定容至100 mL。在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日立)540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度［7］。

1.4.2.2 可溶性糖含量測(cè)定 取干樣0.1 g，加5 ml蒸餾水，沸水中提取30 min，提取液過(guò)濾定容至25 mL容量瓶中。吸取樣品提取液0.5 mL于20 mL刻度試管中，加蒸餾水1.5 mL，在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)630 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度［7］。

1.4.2.3 蛋白含量測(cè)定 取0.5 g樣品，加入2 mL蒸餾水，研磨制勻漿，再加6 mL蒸餾水洗滌后轉(zhuǎn)移到離心管，室溫放置0.5 ～1.0 h 充分提取，然后在4 000 r/min 離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液并定容至10 mL容量瓶中，即為提取液。取0.1 mL提取液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G－250蛋白試劑，放置2 min后，在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)以595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度［7］。

1.4.3 胞外酶活力測(cè)定

1.4.3.1 羧甲基纖維素酶活性測(cè)定 取0.5 mL酶液和1.5 mL pH值為4.6的羧甲基纖維素鈉溶液混合，置于40℃水浴鍋保溫30 min。沸水中煮沸15 min后，取0.5 mL用DNS法測(cè)還原糖生成量。U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)以540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［7］。

1.4.3.2 半纖維素酶活性測(cè)定 將0.5 mL酶液和1 mL 1% 的木聚糖溶液混勻后，在50℃水浴鍋保溫1 h，取出加入2 mL DNS試劑，煮沸5 min。取出待定容至20 mL，以煮沸滅活的酶液作對(duì)照在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［8］。

1.4.3.3 淀粉酶活性測(cè)定 將 0.5 mL pH 值為 5.6的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液和0.5 mL酶液混合勻后40℃水浴15 min，加入40℃ 1%的可溶性淀粉1 mL，混勻，40℃水浴5 min，加入2 mL 0.4 mol/L NaOH。取混合溶液2 mL和2 mL DNS試劑，煮沸5 min，取出冷卻，加入蒸餾水定容至25 mL，在U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)520 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌菌絲生長(zhǎng)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，不同碳源處理對(duì)猴頭菌絲生長(zhǎng)有明顯影響(圖1，表1)。幾種碳源菌絲日均生長(zhǎng)速度從高到低順序是果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞麥芽糖＞淀粉＞乳糖＞纖維素。其中，以果糖或葡萄糖為碳源，猴頭菌菌絲生長(zhǎng)較好，菌絲日均生長(zhǎng)速度分別為0.54、0.51 cm/d。以纖維素為碳源，猴頭菌菌絲生長(zhǎng)最差，菌絲日均生長(zhǎng)速度為0.15 cm/d。

不同氮源處理對(duì)猴頭菌絲生長(zhǎng)也有明顯影響(圖1，表2)。幾種氮源菌絲日均生長(zhǎng)速度從高到低順序是酵母浸粉＞酵母膏＞蛋白胨＞谷氨酰胺＞硝酸銨＞苯丙氨酸＞尿素。其中，以酵母浸粉、酵母膏和蛋白胨為氮源，猴頭菌菌絲生長(zhǎng)較好，菌絲日均生長(zhǎng)速度分別為 0.56、0.54、0.51 cm/d。以尿素為氮源，猴頭菌菌絲生長(zhǎng)最差，菌絲日均生長(zhǎng)速度為 0.03 cm/d。

表1 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

2.2 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體原基品質(zhì)的影響

將猴頭菌進(jìn)行液體培養(yǎng)后，只有葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏5個(gè)處理可以形成子實(shí)體原基。因此，僅對(duì)這5個(gè)處理的子實(shí)體原基品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

2.2.1 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體原基還原糖含量的影響還原糖是指具有還原性的糖類，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖等。研究發(fā)現(xiàn)，氮源的還原糖含量高于碳源的還原糖含量，酵母浸粉和酵母膏的還原糖含量較高，且酵母浸粉的還原糖含量最高。葡萄糖、蔗糖和蛋白胨的還原糖含量較低，顯著低于酵母浸粉和酵母膏，且蔗糖的還原糖含量最低(圖2)。

表2 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

2.2.2 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體原基可溶性糖含量的影響 可溶性糖就是易溶于水的糖，包括絕大部分的單糖、寡糖。研發(fā)發(fā)現(xiàn)，酵母膏可溶性糖的含量最高，顯著高于其他處理;蔗糖的可溶性糖含量次之;酵母浸粉、葡萄糖和蛋白胨可溶性糖含量在同一水平，且蛋白胨的可溶性糖含量最低(圖3)。

2.2.3 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體原基可溶性蛋白含量的影響 可溶性蛋白指可以以小分子狀態(tài)溶于水或其他溶劑的蛋白，是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，整體來(lái)看，氮源處理的可溶性蛋白含量低于碳源處理。蔗糖處理的可溶性蛋白含量最高，顯著高于其他處理;葡萄糖和蛋白胨處理處于同一水平，可溶性蛋白含量?jī)H次于蔗糖處理;酵母膏處理的可溶性蛋白含量最低(圖4)。

2.3 猴頭菌菌絲固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)干質(zhì)量比較

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)具有較高的相關(guān)性。碳源菌絲干質(zhì)量由大到小順序?yàn)槠咸烟牵竟牵菊崽牵钧溠刻牵镜矸郏纠w維素＞乳糖，其r2值為0.958 4。氮源菌絲干質(zhì)量由大到小順序?yàn)榻湍附郏窘湍父啵镜鞍纂耍竟劝滨０罚鞠跛徜@＞尿素＞苯丙氨酸，其r2值為0.904 1(圖5)。

2.4 不同碳、氮源對(duì)猴頭菌胞外酶活性的影響

2.4.1 不同碳、氮源對(duì)羧甲基纖維素酶活性的影響 羧甲基纖維素酶表征了纖維素酶的活性。纖維素酶是一種復(fù)合酶，是胞外酶的重要組成部分。試驗(yàn)結(jié)果表明，尿素處理的羧甲基纖維素酶活性最強(qiáng);酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、果糖處理的羧甲基纖維素酶活性較強(qiáng)，且處于同一水平;乳糖、苯丙氨酸、谷氨酰胺處理羧甲基纖維素酶活性次之;麥芽糖、酵母膏處理羧甲基纖維素酶活性較弱;淀粉和纖維素處理羧甲基纖維素酶活性最弱，且與其他處理差異顯著(圖6)。

2.4.2 不同碳、氮源對(duì)半纖維素酶活性的影響 半纖維素酶是一種重要的復(fù)合酶，能將構(gòu)成植物細(xì)胞膜的多糖類(纖維素和果膠物質(zhì)除外)加水分解的各種酶的總稱。試驗(yàn)結(jié)果表明，谷氨酰胺和硝酸銨處理的半纖維素酶活性最強(qiáng);尿素和苯丙氨酸處理的半纖維素酶活性較強(qiáng);蛋白胨、酵母浸粉、乳糖和葡萄糖誘導(dǎo)半纖維素酶活性在同一水平;酵母膏、蔗糖、果糖、淀粉和纖維素處理半纖維素酶活性最弱(圖7)。

2.4.3 不同碳、氮源對(duì)淀粉酶活性的影響 淀粉酶是指一類能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)糖苷鍵的酶的總稱。試驗(yàn)結(jié)果表明，谷氨酰胺和苯丙氨酸處理的淀粉酶活性最強(qiáng);硝酸銨處理的淀粉酶活性次之;葡萄糖、麥芽糖、酵母浸粉和蛋白胨處理的淀粉酶活性較強(qiáng);果糖、蔗糖、乳糖、酵母膏和尿素誘導(dǎo)淀粉酶活性在同一水平;淀粉和纖維素淀粉酶活性最弱，且與其他處理差異顯著(圖8)。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，猴頭菌菌絲單糖、雙糖、多糖均可以利用。其中以果糖、葡萄糖為碳源的效果較好，蔗糖為碳源的次之，所得到的結(jié)論與賈素巧的研究結(jié)果［10］相似。猴頭菌利用單糖效果好于雙糖，雙糖效果好于多糖，可能是因?yàn)樾》肿游镔|(zhì)可以直接被吸收利用，大分子物質(zhì)需要胞外酶分解后才可利用。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)氮培養(yǎng)基中，猴頭菌菌絲生長(zhǎng)快，與肖光輝等結(jié)論［11］相同，可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源中含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸，水解后提供了可被直接利用的氨基酸。當(dāng)使用無(wú)機(jī)氮為氮源時(shí)，菌絲必須利用無(wú)機(jī)氮合成其需要的各種氨基酸，而某些氨基酸幾乎或完全不能生物合成，所以菌絲長(zhǎng)勢(shì)緩慢［12］。猴頭菌固體培養(yǎng)料中含營(yíng)養(yǎng)成分較為豐富，無(wú)法試驗(yàn)單獨(dú)某一種營(yíng)養(yǎng)對(duì)猴頭菌子實(shí)體品質(zhì)的影響。運(yùn)用液體培養(yǎng)法，在營(yíng)養(yǎng)液中培育出猴頭菌子實(shí)體［13］，可以探究不同碳、氮源對(duì)猴頭菌子實(shí)體的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，在可形成子實(shí)體的碳源處理中，可溶性糖含量和可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)相同，都是蔗糖含量高于葡萄糖。而在可形成子實(shí)體的氮源處理中，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和還原糖含量變化差別較大，說(shuō)明氮源對(duì)子實(shí)體品質(zhì)的影響較大。

胞外酶是細(xì)胞內(nèi)合成在細(xì)胞外起作用的一類酶［14］，食用菌利用胞外酶分解培養(yǎng)料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。木質(zhì)纖維素是大分子物質(zhì)，被分解成小分子物質(zhì)后才能被食用菌吸收利用，食用菌主要通過(guò)分泌相關(guān)的木質(zhì)纖維素酶將木質(zhì)纖維素最終降解為還原糖［15］，且已有研究指出纖維素酶活性最高值、最低值與子實(shí)體產(chǎn)量相關(guān)［16］。在本試驗(yàn)中猴頭菌菌絲在不同碳、氮源培養(yǎng)基中分泌的酶活性不同。其中，羧甲基纖維素酶在尿素處理中產(chǎn)生的活性最高;半纖維素酶在谷氨酰胺和硝酸銨2個(gè)處理中產(chǎn)生的活性較高;淀粉酶在苯丙氨酸和谷氨酰胺2個(gè)處理中產(chǎn)生的活性較高。羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶的整體趨勢(shì)都是氮源處理誘導(dǎo)酶活性高于碳源處理，表明某些氮源可以提高菌絲胞外酶活性。

將生長(zhǎng)指標(biāo)與胞外酶活性聚類分析，羧甲基纖維素酶活性與液體培養(yǎng)菌絲干質(zhì)量相關(guān)性較高，半纖維素酶活性和淀粉酶活性相關(guān)性較高(圖9)。菌絲日生長(zhǎng)速度對(duì)胞外酶活性影響較小。從供試猴頭菌生長(zhǎng)指標(biāo)來(lái)看，氮源酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨和碳源蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖配合效果較好。另外供試碳源和氮源對(duì)菌絲干質(zhì)量積累與羧甲基纖維素酶活性影響趨勢(shì)相近，表明羧甲基纖維素酶可能在菌絲干重積累過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。供試的3種酶活性在不同碳、氮源情況下，可能均優(yōu)先供應(yīng)干物質(zhì)積累。