• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小鼠大腦中動(dòng)脈近端及遠(yuǎn)端阻塞腦缺模型比較

    2018-10-16 03:35:12孔德蓮管樟萌秦敬翠馬海玲
    關(guān)鍵詞:腦缺血神經(jīng)功能體積

    孔德蓮,管樟萌,祖 潔,秦敬翠,馬海玲,陸 燕,何 清*

    (1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬市立醫(yī)院,江蘇 徐州 221001;2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 徐州 221001)

    人類(lèi)的缺血性腦卒中是一種具有復(fù)雜的病理生理學(xué)機(jī)制的異質(zhì)性疾病,所以想要在一個(gè)動(dòng)物模型中模仿人類(lèi)腦卒中的各個(gè)方面是不可行的。目前大部分卒中人群的梗死區(qū)主要在大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA)供血區(qū)內(nèi),所以大部分卒中模型選擇阻斷MCA或者它的一個(gè)分支。傳統(tǒng)的MCAO模型是利用線(xiàn)栓阻塞大腦中動(dòng)脈近端制作的腦缺血模型,簡(jiǎn)稱(chēng)線(xiàn)栓MCAO。但該方法對(duì)術(shù)者技術(shù)要求高,模型制作難度較大,腦損傷體積大,動(dòng)物不易長(zhǎng)期存活,不利于對(duì)腦缺血的長(zhǎng)期研究。大腦中動(dòng)脈永久性閉塞(p-MCAO)模型采取電凝阻斷小鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈血流方法實(shí)現(xiàn)同側(cè)相應(yīng)供血區(qū)皮層發(fā)生缺血性損傷,即所謂的“凝血模型”,該模型尚未像線(xiàn)栓法MCAO模型那樣在各實(shí)驗(yàn)室普及。本研究通過(guò)比較p-MCAO模型與傳統(tǒng)的MCAO模型在模型制作成功率、模型制作成功后的死亡率、腦梗死體積、神經(jīng)行為學(xué)等方面的差異,探討兩種MCAO模型的優(yōu)劣性和應(yīng)用范圍。

    1 實(shí)驗(yàn)大鼠分組及模型制作

    野生型C57BL/6J小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)并繁殖于徐州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究所,飼養(yǎng)條件保持室溫22~25℃,予以12 h光照,12 h黑暗。采用隨機(jī)數(shù)表方法將48只雄性(8-12周,SPF級(jí))野生型小鼠隨機(jī)分為3組:①P-MCAO組(n=18);②線(xiàn)栓組(n=18);③對(duì)照組(n=12)。

    2 遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈永久性閉塞模型(Permanent MCAO Model,P-MCAO)制作過(guò)程

    見(jiàn)圖1[1]。具體步驟為:(1)小鼠用小動(dòng)物吸入麻醉系統(tǒng),異氟烷麻醉(2)小鼠右側(cè)臥位于手術(shù)臺(tái)上,應(yīng)用脫毛劑(8%硫化鈉)將左側(cè)眼部至耳部的毛發(fā)脫凈,解剖顯微鏡下在消毒后的區(qū)域切開(kāi)1 cm的切口。(3)分離皮膚并定位顳肌,掀開(kāi)肌肉。(4)在透明的顱骨下找到“Y”型大腦中動(dòng)脈分支的近端及遠(yuǎn)端動(dòng)脈分叉。(5)用骨鉆在血管分叉處打磨顱骨直至顱骨變得薄薄的一層,用精細(xì)鑷小心地將動(dòng)脈上方的顱骨掀開(kāi)。正確分辨出MCA的分支,分別距離分叉處1 mm電凝三支動(dòng)脈血管。(6)縫合傷口。

    圖1 P-MCAO模型示意圖[2]

    2.1 線(xiàn)栓組傳統(tǒng)的MCAO模型制作[3,4]

    手術(shù)分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,微動(dòng)脈夾暫時(shí)關(guān)閉頸總動(dòng)脈,由頸外動(dòng)脈注入栓子后將頸外動(dòng)脈結(jié)扎,開(kāi)放頸總動(dòng)脈,使栓子自頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入MCA而建立MCAO模型。

    2.2 對(duì)照組

    正常飼養(yǎng),未予任何手術(shù)處理。

    2.3 小鼠腦缺血模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)

    按照參考文獻(xiàn)[5]評(píng)定,在造模后18 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評(píng)價(jià):0級(jí)=無(wú)缺陷; l級(jí)=對(duì)側(cè)前肢不能伸展;2級(jí)=對(duì)側(cè)前肢屈曲; 3級(jí)=輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;4級(jí)=嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈;5級(jí)=對(duì)側(cè)癱瘓。

    2.4 TTC染色測(cè)定腦梗死體積[6]

    分別取各組術(shù)后(或者假手術(shù)后)24小時(shí)的小鼠,取腦,制作冰凍切片,將切片置于TTC染液中,用錫箔紙蓋住后(避光),放入37℃保溫箱中15~30 min。將數(shù)碼相機(jī)固定于腦片垂直上方30 cm處拍照。正常腦組織中線(xiàn)粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶與TTC反應(yīng)呈鮮紅色,梗死區(qū)由于缺少線(xiàn)粒體而不著色。拍照后利用Image Pro Plus 6.0軟件分別測(cè)出梗死側(cè)非梗死區(qū)的面積和對(duì)側(cè)半球的面積。兩者之差即為腦梗死面積,再除以對(duì)側(cè)半球面積,即為相對(duì)腦梗死面積比,依次得出5個(gè)相對(duì)腦梗死面積比,乘以2 mm即為相對(duì)腦梗死體積比[8]。

    2.5 大鼠神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)比較

    模型建立后,進(jìn)行兩項(xiàng)行為學(xué)檢測(cè)比較,包括上提肢體搖擺實(shí)驗(yàn)(elevated body swing test,EBST)[7]和圓柱筒實(shí)驗(yàn)[8,9]。行為學(xué)檢測(cè)采用雙盲法。術(shù)前24小時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練,只有行為學(xué)表現(xiàn)符合要求的才可入組并繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。術(shù)后24 h再次進(jìn)行行為學(xué)測(cè)驗(yàn)。

    2.5.1 EBST

    主要用于評(píng)價(jià)小鼠的肢體翻轉(zhuǎn)功能及前肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱(chēng)性。術(shù)后24小時(shí),觀察者提起小鼠尾巴根部,距離地面約10 cm,記錄小鼠向左右搖擺的次數(shù),搖擺角度需>10度,<10度則不計(jì)入總數(shù),20次為限。該方法主要用來(lái)觀察小鼠肢體運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱(chēng)性。計(jì)算小鼠左右搖擺的比例并加以統(tǒng)計(jì)。

    2.5.2 圓柱筒試驗(yàn)

    正式實(shí)驗(yàn)前3天內(nèi)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次行為學(xué)訓(xùn)練,訓(xùn)練時(shí)情緒過(guò)于緊張/躍出筒內(nèi)者,或者10 min內(nèi)貼壁次數(shù)小于5次者,不參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別在術(shù)前1天、術(shù)后1天用攝像機(jī)記錄,每次記錄10分鐘,每只小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄2次,2次的時(shí)間間隔至少為30分鐘。應(yīng)用視頻軟件慢放的功能,分別計(jì)數(shù)每只小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)左前肢觸壁(L),右前肢觸壁(R)及雙側(cè)前肢同時(shí)觸壁(D)次數(shù),最終取每一小鼠同一時(shí)間點(diǎn)的兩次計(jì)數(shù)的均值帶入公式計(jì)算:行為學(xué)得分/score=(R+D/2)/(R+L=D)×100%。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以±s表示,分別進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié) 果

    3.1 腦卒中小鼠24 h存活率、腦梗死體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    (1)建模后24 h內(nèi),P-MCAO組死亡1只,余17只繼續(xù)進(jìn)行行為學(xué)觀察。線(xiàn)栓法組死亡5只,余13只繼續(xù)行為學(xué)觀察。線(xiàn)栓組死亡率>p-MCAO組。對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。(2)TTC染后,p-MCAO組和線(xiàn)栓組,均清晰可見(jiàn)腦梗死區(qū)域(白色區(qū)域?yàn)楣K绤^(qū)域) ,但梗死區(qū)域在線(xiàn)栓組明顯大于p-MCAO組(圖2)。兩組腦梗死體積比較較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表1,圖2。

    3.2 腦卒中行為學(xué)觀測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    ①EBST實(shí)驗(yàn):p-MCAO組、線(xiàn)栓組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);p-MCAO組與線(xiàn)栓組比較,無(wú)顯著差異(表2)。

    圖2 線(xiàn)栓組(A)和p-MCAO組(B)腦缺血模型TTC染色結(jié)果

    ②玻璃圓筒貼壁實(shí)驗(yàn):p-MCAO組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);線(xiàn)栓組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);p-MCAO組與線(xiàn)栓組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

    表1 兩組相對(duì)腦梗死體積結(jié)果( ±s)

    表1 兩組相對(duì)腦梗死體積結(jié)果( ±s)

    注:兩組相對(duì)腦梗死體積比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

    分組(group) 相對(duì)腦梗死體積(%)線(xiàn)栓組(n=17) 57.35±5.12 P-MCAO組(n=13) 32.87±3.79

    表2 各組大鼠行為學(xué)評(píng)估( ±s)

    表2 各組大鼠行為學(xué)評(píng)估( ±s)

    注:與對(duì)照組比較,1P<0.05;與線(xiàn)栓組比較,2P<0.05

    組別/行為學(xué)評(píng)分上提肢體搖擺試驗(yàn)評(píng)分(%)圓柱筒試驗(yàn)評(píng)分(%)對(duì)照組 20.11±3.32 0.27±0.10線(xiàn)栓組 0.00±0.001 42.23±0.021 P-MCAO組 12.11±0.021,2 15.92±2.171,2

    4 討 論

    腦缺血是以腦循環(huán)血流量減少為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn),嚴(yán)重地影響人類(lèi)的生存質(zhì)量。目前我國(guó)腦血管疾病占人群死亡病因的第二位。因此,模擬人類(lèi)缺血性腦血管病的發(fā)病過(guò)程,建立重復(fù)性好、觀測(cè)指標(biāo)易于控制的腦缺血?jiǎng)游锬P鸵恢笔侨藗兤毡殛P(guān)注的課題。因此,在過(guò)去的幾十年中,本著研究腦缺血的機(jī)制以及尋找更有效的治療藥物,研究者們開(kāi)發(fā)了許多腦缺血的動(dòng)物模型。

    腦缺血?jiǎng)游锬P桶床课环譃榫衷钚阅X缺血模型和全腦缺血模型;臨床上,缺血性腦血管病多為局灶性,以大腦中動(dòng)脈(middle cerebral anery,MCA)及其分支閉塞(middle cerebral artery occlusion,MACO)多見(jiàn),約占腦梗死的70%。因此,制作MCA缺血并且可實(shí)現(xiàn)再灌注的動(dòng)物模型更接近臨床。MCA模型被公認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)的局灶性腦缺血?jiǎng)游锬P?。其中,電凝法?981年由Tamura等首先建立,并經(jīng)Bederson,Osborne、Shigeno等進(jìn)一步改良,2014年由Llovera[10,11]等改良后建立了電凝經(jīng)顱永久性遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈閉塞模型(P-MCAO),本模型的優(yōu)勢(shì)在于造模的死亡率低,重復(fù)性好。同時(shí)梗死區(qū)主要在皮層,梗死面積的大小與大部分卒中患者的梗死體積具有一致性[11]。線(xiàn)栓塞法是手術(shù)分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,微動(dòng)脈夾暫時(shí)關(guān)閉頸總動(dòng)脈,由頸外動(dòng)脈注入栓子后將頸外動(dòng)脈結(jié)扎,開(kāi)放頸總動(dòng)脈,使栓子自頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入MCA而建立MCAO模型。

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TTC染色后對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠進(jìn)行梗死面積分析,獲得直接測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù),兩種不同造模方法所造成的腦梗死體積明顯不同。線(xiàn)栓法MCAO梗死區(qū)域主要局限于一側(cè)半球皮質(zhì)區(qū)和紋狀體(圖2A),p-MCAO組梗死區(qū)域主要局限于一側(cè)皮質(zhì)區(qū)(圖2B),且兩者之間梗死體積的比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明MCA損傷段不同,產(chǎn)生的腦梗死體積也不同。線(xiàn)栓法腦缺血模型主要阻塞MCA起始段,同時(shí)影響CCA,ICA的部分灌注,所以產(chǎn)生的梗死區(qū)域較大,影響也比較廣泛。而p-MCAO法直接電凝MCA遠(yuǎn)端,對(duì)CCA,ICA等無(wú)影響,所以梗死區(qū)域局限于MCA遠(yuǎn)端供血區(qū),對(duì)大鼠的神經(jīng)功能影響也較局限。

    行為學(xué)研究在神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)功能研究中占有舉足輕重的地位,本實(shí)驗(yàn)中小鼠的兩種不同的缺血模型對(duì)神經(jīng)功能的影響是不同的,且不同的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)神經(jīng)功能的評(píng)定的側(cè)重點(diǎn)也是不同的。通過(guò)EBST,圓柱筒試驗(yàn)兩種行為學(xué)功能的檢測(cè)比較,表面在腦卒中幾星期p-MCAO會(huì)對(duì)小鼠造成一定的神經(jīng)功能的損傷,但不及線(xiàn)栓法腦缺血模型對(duì)小鼠造成的神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重。

    綜上,p-MCAO由于對(duì)MCA的損傷位于遠(yuǎn)端,造成的腦梗死面積較小,腦梗死局限于大腦皮質(zhì)前側(cè)面及少量皮質(zhì)下腦組織,模型制作完成后小鼠存活時(shí)間較長(zhǎng),適合涉及為期較長(zhǎng)的行為學(xué)測(cè)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)。許多研究,像對(duì)藥物的評(píng)價(jià)研究,干細(xì)胞治療后的長(zhǎng)期療效研究等等,需要長(zhǎng)期觀察才能得出結(jié)論,應(yīng)用此模型較為合適。而線(xiàn)栓法腦缺血模型對(duì)動(dòng)物損傷大,模型制作完成后小鼠存活時(shí)間較短,適宜短期的腦缺血后的行為學(xué)及生理/病理/機(jī)制等的研究。

    猜你喜歡
    腦缺血神經(jīng)功能體積
    多法并舉測(cè)量固體體積
    間歇性低氧干預(yù)對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
    聚焦立體幾何中的體積問(wèn)題
    小體積帶來(lái)超高便攜性 Teufel Cinebar One
    誰(shuí)的體積大
    原花青素對(duì)腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護(hù)作用
    血必凈對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制
    不同程度神經(jīng)功能缺損的腦梗死患者血尿酸與預(yù)后的相關(guān)性研究
    細(xì)胞外組蛋白與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的初探
    辛伐他汀對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用及其機(jī)制探討
    av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品久久国产蜜桃| 黑人高潮一二区| 一本色道久久久久久精品综合| 一本色道久久久久久精品综合| xxx大片免费视频| 精品午夜福利在线看| 亚洲自偷自拍三级| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品女同一区二区软件| 五月玫瑰六月丁香| 国产视频首页在线观看| 在线观看免费高清a一片| 天美传媒精品一区二区| 亚洲av一区综合| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久影院123| 免费观看无遮挡的男女| 99久久精品国产国产毛片| 国产成人aa在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 又爽又黄无遮挡网站| 又爽又黄无遮挡网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国国产精品蜜臀av免费| 国国产精品蜜臀av免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产精品久久久久久久电影| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲第一区二区三区不卡| 国内精品美女久久久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久热精品热| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 男女下面进入的视频免费午夜| 男女下面进入的视频免费午夜| 中国三级夫妇交换| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲电影在线观看av| 大话2 男鬼变身卡| 中文欧美无线码| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| av免费观看日本| 欧美精品国产亚洲| 超碰av人人做人人爽久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 插阴视频在线观看视频| 男插女下体视频免费在线播放| 99久国产av精品国产电影| 国产乱来视频区| 久久精品久久久久久久性| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品一二三区在线看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av专区在线播放| 十八禁网站网址无遮挡 | 18禁在线播放成人免费| 欧美成人a在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 欧美 日韩 精品 国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品一区www在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 日本一本二区三区精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品不卡视频一区二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 黄色日韩在线| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 成人黄色视频免费在线看| 日韩大片免费观看网站| 免费大片18禁| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲成人一二三区av| av黄色大香蕉| 国产一区二区三区综合在线观看 | 少妇的逼水好多| 精品熟女少妇av免费看| 精品人妻视频免费看| 日韩大片免费观看网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜福利视频1000在线观看| 99热这里只有精品一区| 日韩电影二区| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 91精品伊人久久大香线蕉| 男人和女人高潮做爰伦理| 又爽又黄a免费视频| 久久久久国产网址| 亚洲欧美精品专区久久| 一级毛片电影观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 最近手机中文字幕大全| 秋霞在线观看毛片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产又色又爽无遮挡免| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 我的女老师完整版在线观看| 深爱激情五月婷婷| 插阴视频在线观看视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产欧美日韩精品一区二区| kizo精华| 国产乱人视频| 午夜激情久久久久久久| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲在线观看片| 色5月婷婷丁香| 在线精品无人区一区二区三 | 国产在线一区二区三区精| 热re99久久精品国产66热6| 国产91av在线免费观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美+日韩+精品| 国产一区二区三区综合在线观看 | 婷婷色av中文字幕| 最近最新中文字幕大全电影3| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 色综合色国产| 国产爱豆传媒在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 国产黄片视频在线免费观看| 99久久精品国产国产毛片| 中文字幕制服av| 麻豆成人av视频| 26uuu在线亚洲综合色| 精品久久久精品久久久| 尾随美女入室| 七月丁香在线播放| 一本色道久久久久久精品综合| 在线观看免费高清a一片| tube8黄色片| 国产爱豆传媒在线观看| 综合色丁香网| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99久国产av精品国产电影| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲av.av天堂| 精品一区二区三区视频在线| 色综合色国产| av一本久久久久| 最近的中文字幕免费完整| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲综合色惰| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久国产一区二区| 青春草国产在线视频| 亚洲色图av天堂| 大码成人一级视频| 嘟嘟电影网在线观看| 国产熟女欧美一区二区| av在线天堂中文字幕| 欧美成人午夜免费资源| 国产黄色免费在线视频| 春色校园在线视频观看| 亚洲精品一二三| 26uuu在线亚洲综合色| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品国产av在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 99久国产av精品国产电影| 中文资源天堂在线| 亚洲av免费在线观看| 99热6这里只有精品| 网址你懂的国产日韩在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 在线免费十八禁| 欧美+日韩+精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品.久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美最新免费一区二区三区| 成人漫画全彩无遮挡| 又爽又黄a免费视频| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国精品久久久久久国模美| 男女那种视频在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久久九九精品影院| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 大码成人一级视频| 日本三级黄在线观看| 久久精品人妻少妇| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲无线观看免费| 国产成人福利小说| 老女人水多毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲国产精品999| av免费在线看不卡| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产高清在线一区二区三| 超碰av人人做人人爽久久| tube8黄色片| 91aial.com中文字幕在线观看| 禁无遮挡网站| 成人一区二区视频在线观看| 精品国产三级普通话版| 超碰97精品在线观看| 永久网站在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日韩三级伦理在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产黄色免费在线视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 舔av片在线| 国产在线一区二区三区精| 国产黄片美女视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲,欧美,日韩| 三级经典国产精品| 中文欧美无线码| 国国产精品蜜臀av免费| 午夜福利视频精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产成人午夜福利电影在线观看| 在线看a的网站| 日日撸夜夜添| 精品久久久精品久久久| 观看免费一级毛片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲av.av天堂| 午夜福利视频1000在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 99久久精品国产国产毛片| 成人欧美大片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲性久久影院| 亚洲国产欧美在线一区| 国产在线一区二区三区精| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩欧美精品免费久久| 高清视频免费观看一区二区| 久久久精品94久久精品| 成年女人在线观看亚洲视频 | 成人欧美大片| 亚洲av福利一区| 高清毛片免费看| 日本与韩国留学比较| 亚洲国产色片| 永久网站在线| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美激情久久久久久爽电影| 观看美女的网站| 免费人成在线观看视频色| 亚洲伊人久久精品综合| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品视频女| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲国产色片| 国产熟女欧美一区二区| 97热精品久久久久久| 免费看光身美女| 久久ye,这里只有精品| 中文字幕久久专区| 国产一区亚洲一区在线观看| 男女那种视频在线观看| 中国三级夫妇交换| 国产综合懂色| 一级毛片 在线播放| 国产91av在线免费观看| 久久精品国产自在天天线| 国产成人aa在线观看| 久久午夜福利片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 91久久精品国产一区二区三区| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲精品乱久久久久久| 真实男女啪啪啪动态图| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 2018国产大陆天天弄谢| 久久久久久久亚洲中文字幕| 黑人高潮一二区| 亚洲av在线观看美女高潮| 成人黄色视频免费在线看| 日韩一区二区三区影片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 简卡轻食公司| 久久热精品热| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 三级国产精品欧美在线观看| 日本欧美国产在线视频| 国产午夜福利久久久久久| 美女内射精品一级片tv| 国产成人freesex在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产高清三级在线| 各种免费的搞黄视频| 国产久久久一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 成人午夜精彩视频在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩一区二区视频免费看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲美女视频黄频| 久久久久久久久久久丰满| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品伦人一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久国产乱子免费精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 香蕉精品网在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品久久久久久精品古装| 2021天堂中文幕一二区在线观| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 两个人的视频大全免费| 国产片特级美女逼逼视频| 大话2 男鬼变身卡| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品自拍成人| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产极品天堂在线| 性色av一级| 一区二区三区精品91| 国产乱来视频区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 最近的中文字幕免费完整| 日韩人妻高清精品专区| 少妇人妻精品综合一区二区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品国产三级国产专区5o| 日韩一本色道免费dvd| 国产美女午夜福利| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 人妻系列 视频| 亚洲真实伦在线观看| 午夜激情福利司机影院| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99热全是精品| av播播在线观看一区| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲欧美日韩无卡精品| 中文字幕免费在线视频6| 在线观看一区二区三区| 内地一区二区视频在线| 我的女老师完整版在线观看| 精品一区二区三卡| 九色成人免费人妻av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 在线观看三级黄色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲,欧美,日韩| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产成人freesex在线| av在线播放精品| 伦理电影大哥的女人| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 天堂中文最新版在线下载 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产欧美亚洲国产| av卡一久久| 黄色日韩在线| 亚洲av免费高清在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 老司机影院成人| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品一区www在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产在线一区二区三区精| 亚洲伊人久久精品综合| 精品久久久噜噜| 一边亲一边摸免费视频| 日韩成人伦理影院| 丝袜美腿在线中文| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久网色| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 如何舔出高潮| 99久久精品热视频| 欧美97在线视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品不卡视频一区二区| 国精品久久久久久国模美| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲高清免费不卡视频| av在线蜜桃| 丝袜脚勾引网站| 国产极品天堂在线| 午夜精品国产一区二区电影 | 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久精品国产自在天天线| 久久精品国产a三级三级三级| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲三级黄色毛片| 嫩草影院精品99| 欧美+日韩+精品| 在线观看免费高清a一片| 熟女电影av网| 欧美xxxx性猛交bbbb| 中文欧美无线码| 亚洲久久久久久中文字幕| 色吧在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 2018国产大陆天天弄谢| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产成人免费无遮挡视频| 高清午夜精品一区二区三区| 简卡轻食公司| 成人黄色视频免费在线看| 99久久人妻综合| 制服丝袜香蕉在线| 日韩免费高清中文字幕av| 国产高潮美女av| 天堂俺去俺来也www色官网| 26uuu在线亚洲综合色| 又爽又黄a免费视频| 一级片'在线观看视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产黄片视频在线免费观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 久久99热这里只频精品6学生| 女人久久www免费人成看片| 婷婷色综合www| 日韩一本色道免费dvd| 婷婷色av中文字幕| 亚洲国产av新网站| 联通29元200g的流量卡| 舔av片在线| 国产精品.久久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品456在线播放app| 少妇丰满av| 国产色爽女视频免费观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品视频女| 久热久热在线精品观看| 99热网站在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲,一卡二卡三卡| 人体艺术视频欧美日本| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| eeuss影院久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久久久国产a免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 91久久精品国产一区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| 一级毛片我不卡| 日韩欧美 国产精品| 亚洲国产色片| 在线观看av片永久免费下载| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲性久久影院| 国产高清国产精品国产三级 | 国产成人精品一,二区| 我的女老师完整版在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成年av动漫网址| 欧美bdsm另类| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 看黄色毛片网站| 国产亚洲最大av| 另类亚洲欧美激情| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国国产精品蜜臀av免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| a级毛片免费高清观看在线播放| 午夜视频国产福利| 精品一区在线观看国产| 成人一区二区视频在线观看| 18禁在线播放成人免费| 国产av码专区亚洲av| 免费黄色在线免费观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲av一区综合| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产亚洲一区二区精品| 亚州av有码| 色5月婷婷丁香| 婷婷色综合www| 久久99蜜桃精品久久| 国产色爽女视频免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 亚洲精品色激情综合| 欧美激情国产日韩精品一区| 一本一本综合久久| 日韩欧美精品v在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本爱情动作片www.在线观看| 日本黄大片高清| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产亚洲91精品色在线| 免费看光身美女| 亚洲国产色片| 亚洲欧洲国产日韩| 人人妻人人看人人澡| 欧美成人a在线观看| 男人舔奶头视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| .国产精品久久| 少妇熟女欧美另类| 草草在线视频免费看| a级一级毛片免费在线观看| 嫩草影院入口| 婷婷色麻豆天堂久久| 涩涩av久久男人的天堂| 国产综合精华液| 免费观看av网站的网址| 国产精品伦人一区二区| 九色成人免费人妻av| 久久久久久久久久久免费av| 久久久久国产精品人妻一区二区| www.色视频.com| 色5月婷婷丁香| 亚洲四区av| 少妇被粗大猛烈的视频| 少妇的逼水好多| 插阴视频在线观看视频| 久久国产乱子免费精品| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久午夜福利片| 日本与韩国留学比较| 夜夜爽夜夜爽视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产极品天堂在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 22中文网久久字幕| 亚洲图色成人| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久久精品94久久精品| 国产高清不卡午夜福利| 干丝袜人妻中文字幕| 九色成人免费人妻av| 免费av不卡在线播放| 美女高潮的动态| 少妇的逼好多水| 在线a可以看的网站| 国产精品久久久久久精品古装| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美最新免费一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品久久久久久久久av| 国产精品一区二区在线观看99| 精品一区二区三区视频在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产视频内射| 日韩电影二区| 日韩av免费高清视频| 欧美日本视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 寂寞人妻少妇视频99o| 成人鲁丝片一二三区免费| 美女国产视频在线观看| 成人欧美大片| 色播亚洲综合网| 亚洲第一区二区三区不卡| a级毛色黄片| 亚洲国产精品专区欧美| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 51国产日韩欧美| 亚洲精品日韩av片在线观看| 在线观看人妻少妇|