食品能力驗證中沙門氏菌的分離鑒定和分型

章海通，邢家溧，傅曉，王紹輝，張銘倩，周霞霞，吳瑩瑩，毛玲燕

（寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江寧波315048）

沙門氏菌是最常見的人畜共患的食源性致病菌之一，屬腸桿菌科，革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于自然界，易污染水源、各類食品和禽畜產(chǎn)品等，嚴重危害人類健康，易引起諸如傷寒、急性腸胃炎、敗血癥等[1]疾病。在食物中毒案例中，由沙門氏菌所致的細菌性食物中毒爆發(fā)起數(shù)和發(fā)病人數(shù)多年來位居我國首位[2]。據(jù)統(tǒng)計，在我國內(nèi)陸地區(qū)，由沙門氏菌引起的細菌性食物中毒占 70%～80%[3]。因此，GB 29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》[4]規(guī)定各類食品中沙門氏菌均不得檢出。能力驗證是利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準則評價參加者的能力[5]，它是評價實驗室技術(shù)能力的重要手段之一，也是實驗室外部質(zhì)量評估的重要方式。通過能力驗證能夠評價實驗室從事特定檢測的能力，識別存在的問題并加以改進，提高實驗室的檢測檢驗?zāi)芰Φ萚6]。

沙門氏菌屬分為腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）和邦戈爾沙門氏菌（Salmonella bongori）兩個種，腸道沙門氏菌又分為6個亞種，因其血清型種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的有2 500多個血清型[7]，完全根據(jù)細菌形態(tài)、生化和血清分型，不僅費時費力，且由于血清的質(zhì)量差異和實驗人員的相關(guān)經(jīng)驗欠缺，容易導(dǎo)致錯誤的分型，因此本文除了使用國標GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》進行沙門氏菌生化和血清檢驗，還采用全自動熒光酶聯(lián)免疫檢測儀（miniVIDAS）和BAXRSystem Q7病原微生物快速檢測系統(tǒng)進行快速篩選，并利用全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（R iboPrinter）進行菌種鑒定的方法，并對傳統(tǒng)國標方法、酶聯(lián)免疫法和分子生物學(xué)3種測定方法的結(jié)果進行了分析討論，總結(jié)出能力驗證沙門氏菌的分離鑒定的注意事項，以期為相關(guān)檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）標準菌株（Salmonella typhimurium CICC 22956）（編號分別為CODE028、CODE069的白色樣品，采用西林瓶真空密閉包裝）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；2袋質(zhì)量均為25 g的奶粉樣品（編號分別為CODE028、CODE069）：中國食品藥品檢定研究院。每個相同編號的沙門氏菌樣品和奶粉樣品為一件樣品進行檢測。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（tetrathionate broth，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（selenite cystine broth，SC）、亞硫酸鉍瓊脂（bismuth sulfite agar，BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（xylose lysine desoxycholate agar，XLD）、HE 瓊脂（hektoen enteric agar，HE）、三糖鐵瓊脂（triple sugar iron agar，TSI）、腦心浸液肉湯（Brain Heart Infusion Broth，BHI）、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、Swarm 瓊脂（swarm agar，SA）：北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基：法國科瑪嘉公司；API20E鑒定試劑盒、VIDAS沙門氏菌檢測試劑條：法國生物梅里埃公司；沙門氏菌快速檢測試劑盒：杜邦公司；沙門氏菌屬診斷血清：寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3 主要儀器

二級生物安全柜（1378）：美國Thermo Fisher公司；恒溫培養(yǎng)箱（IF750）：德國memmert公司；高壓滅菌器HVE-50：日本HIR AYAMA；全自動熒光酶聯(lián)免疫檢測儀miniVIDAS：法國生物梅里埃公司；病原微生物快速檢測系統(tǒng)BAXRSystem Q7、全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)R iboPrinter：杜邦公司。

1.4 試驗與方法

按照組織方提供的作業(yè)指導(dǎo)書進行沙門氏菌檢驗，依據(jù)GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》[8]進行檢驗，并輔助以酶聯(lián)免疫法和分子生物學(xué)檢測方法進行快速篩選，結(jié)合全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（R iboPrinter）進行菌種鑒定，進一步比較國標方法與分子生物學(xué)方法。

1.4.1 樣品前處理

在生物安全柜內(nèi)，無菌操作開啟西林瓶，將西林瓶內(nèi)的白色小球加入到225 mL已滅菌的BPW增菌液中，充分溶解，再將與西林瓶相同編號的奶粉樣品加入到上述BPW增菌液中，用拍擊式均質(zhì)器充分均質(zhì)混勻。然后置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h。同時接種標準菌株鼠傷寒沙門氏菌（CICC 22956）于225mL已滅菌的BPW增菌液中，于恒溫培養(yǎng)箱中36℃，靜置培養(yǎng)18 h，作為陽性對照。

1.4.2 選擇性增菌

輕輕搖勻培養(yǎng)后的樣品混合物，各取1 mL分別轉(zhuǎn)接于10 mL TTB增菌液和10 mL的SC增菌液中，TTB于（42±1）℃培養(yǎng)24 h，SC于（36±1）℃培養(yǎng) 24 h。

1.4.3 分離培養(yǎng)

輕搖混勻上述培養(yǎng)物，用無菌接種環(huán)各取一環(huán)增菌液，分別接種于BS、XLD、HE、科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，其中接種于BS培養(yǎng)基的（36±1）℃培養(yǎng)48 h，接種于其他培養(yǎng)基的于（36±1）℃培養(yǎng)24 h，然后觀察各個平板上的菌落形態(tài)，是否有可疑菌落生長。

1.4.4 生化試驗

分別挑取1.4.3得到的典型和可疑沙門氏菌屬菌落各2個以上，分別接種于三糖鐵瓊脂、TSA平板和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)24 h。用API20E鑒定試劑盒對純化后的菌落進行生化鑒定。

1.4.5 血清鑒定

值得注意的是，在Gold等的實驗中[6]，相同的彈體以較高撞擊初速侵徹混凝土靶板后還有彈體殘余，而在撞擊初速度較低時，彈體完全銷蝕，這也許是其實驗數(shù)據(jù)分散的原因。雖然如此，總體上講，模型預(yù)測的侵徹深度與實驗數(shù)據(jù)大致吻合。從圖11中可以明顯看出，本文模型預(yù)測結(jié)果與錐形銅彈侵徹混凝土靶板的實驗數(shù)據(jù)吻合較好。

生化鑒定符合沙門氏菌的菌株需做血清凝集試驗。在玻璃培養(yǎng)皿上劃出約1 cm見方的網(wǎng)格狀的區(qū)域,在其中一個區(qū)域加1滴多價菌體（O）抗血清，在另一區(qū)域加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)各取一環(huán)待測菌，分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌落研磨成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min，在黑背景對照下進行觀察，如有凝集現(xiàn)象即為陽性反應(yīng)。將分離純化菌株按照GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》標準中的血清學(xué)分型進行O抗原和H抗原的鑒定。

H抗原只檢出一個相，用相位變異法檢查另一個相，單相菌不做相位變異檢查。采用簡易平板法進一步執(zhí)行相位變異法實驗，具體為：將Swarm瓊脂平板表面水分烘干，滴一滴已知相的誘導(dǎo)血清于Swarm瓊脂中央，稍等片刻，待瓊脂將血清吸收，將待檢菌株點種于血清中央，培養(yǎng)后，取蔓延生長的菌苔邊緣部分檢查。

1.4.6 miniVIDAS檢測

分別取1.4.2中培養(yǎng)過的TTB和SC增菌液各5mL，于100℃煮沸15 min。吸取上述滅活后的增菌液各0.5 mL加入沙門氏菌VIDSA檢測試劑條中，按儀器使用規(guī)程上機檢測。

1.4.7 BAXRSystemQ7病原微生物快速檢測系統(tǒng)檢測

取1 mL裂解緩沖液再加入12.5 μL蛋白酶混勻，吸取200 μL上述混勻后的裂解液加入各裂解管，取5 μL樣品加至每個裂解管，將上述裂解管放置于設(shè)置好的加熱模塊上，進行裂解。設(shè)置PCR管，將冷卻的PCR管放上PCR管匹配板后插入冷卻模塊，隨后在PCR管中加入30 μL裂解液，用專配的PCR管蓋密封，上機擴增及檢測。

1.4.8 R iboPrinter基因指紋圖譜鑒定系統(tǒng)的鑒定

挑取1.4.4TSA上的純菌落，用50 μL樣品緩沖液制成懸液，取30 μL于樣品杯中，熱滅活后加入裂解液，置樣品孔中并運行程序。將得到的待測菌株的DNA基因指紋圖譜，與DuPont的數(shù)據(jù)庫進行比對，分析待測菌株的信息，進行細菌鑒定和分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 增菌和選擇性分離結(jié)果

能力驗證的組織方為了增加難度，某些樣品的目標菌并非加在白色小球中，而是加在奶粉樣品中，或者在奶粉樣品中加入抑菌物質(zhì)如抗生素，這種情況在以往的能力驗證過程中曾出現(xiàn)過，這就要求參與的實驗室應(yīng)嚴格按照作業(yè)指導(dǎo)書的要求處理樣品。樣品增菌液的生長情況及選擇性平板上的菌落特征見表1。

表1 樣品增菌液的生長情況及選擇性平板上的菌落特征Table 1 The growth condition of sample enrichment solution and the colony characteristics of Salmonella isolated from selective culture media

沙門顯色培養(yǎng)基上菌落呈紫紅色，這與說明書上描述的沙門氏菌特征相符，表明這些培養(yǎng)基上的菌落都是典型的沙門氏菌菌落特征。在沙門氏菌的分離培養(yǎng)方面，有研究表明[10]，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基的敏感性和特異性都明顯高于XLD和HE，因此建議使用顯色培養(yǎng)基更方便高效的把目標菌和干擾菌區(qū)分開。同時從選擇性平板上挑取可疑菌落進行純化時盡量多挑取幾個不同形態(tài)的可疑菌落，避免漏檢。挑取上述選擇性平板上的菌落純化至營養(yǎng)瓊脂（NA），做后續(xù)的生化試驗及進一步的分離鑒定。將樣品CODE028在BS、XLD、HE、沙門顯色培養(yǎng)基上的上述形態(tài)的菌落分別標記為 1-1、1-2、1-3、1-4；樣品 CODE069 在 BS、XLD、HE、沙門顯色培養(yǎng)基上的上述形態(tài)的菌落分別標記為 2-1、2-2、2-3、2-4。同時將 BS 上的灰綠色菌落，XLD上黃色菌落，HE上黃色菌落等疑似菌落也純化至營養(yǎng)瓊脂（NA）。

2.2 生化試驗

從選擇性平板分離純化的菌株經(jīng)API20E生化鑒定，樣品CODE028和CODE069都為沙門氏菌，具體試驗結(jié)果見表2。

表2 分離菌株生化試驗結(jié)果Table 2 The biochemical test results of strain isolated from the samples

最后將選擇性平板上所有非典型菌落純化后接種BHI（36±1）℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)miniVIDAS和BAXRSystem Q7病原微生物快速檢測系統(tǒng)檢測均為沙門氏菌陰性，后續(xù)經(jīng)鑒定為奇異變形桿菌和弗氏檸檬酸桿菌。

2.3 分離菌株血清試驗結(jié)果

血清分型是一項繁瑣而又工作量大的試驗。血清的質(zhì)量對血清分型至關(guān)重要，目前國產(chǎn)的血清品質(zhì)有待提高，有條件的實驗室可以使用國產(chǎn)和進口兩種血清相互驗證，盡量排除血清對試驗結(jié)果的影響[11]。將分離純化并經(jīng)生化鑒定為沙門氏菌的菌株做血清試驗。具體血清型見表3。

表3 分離菌株血清分型結(jié)果Table 3 The serotype results of strain isolated from the samples

先用A～F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水作為陰性對照，結(jié)果CODE028和CODE069均凝集，再做O血清凝集試驗，結(jié)果均為O4凝集，屬于B群，根據(jù)O單因子血清的試驗結(jié)果來確定O抗原成分。同時用Swarm瓊脂平板鑒定H抗原的第一相和第二相，最終確定血清型。結(jié)果顯示，CODE028和CODE069均為鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）。

2.4 miniVIDAS快速篩選和BAXRSystem Q7快速檢測結(jié)果

取TTB和SC滅活后的增菌液各0.5 mL，加入沙門氏菌檢測試劑條，按儀器操作說明書檢測；取BPW增菌液5 μL經(jīng)裂解，再取30 μL裂解液加入PCR管，按BAXRSystem Q7操作規(guī)程檢測，結(jié)果見表4、圖1。

表4 miniVIDAS快速篩選及BAXRSystem Q7快速檢測結(jié)果Table 4 R apid screening results of miniVIDAS and BAXR System Q7

圖1 PCR擴增曲線圖Fig.1 PCR amplification curve

結(jié)果顯示，CODE028和CODE069兩個樣品的兩種選擇性增菌液和BPW都為檢出沙門氏菌，且陽性對照也是檢出沙門氏菌，這與選擇性平板的分離結(jié)果一致。miniVIDAS是全自動酶免疫分析技術(shù)具有快速、簡單、靈敏度高，不需純培養(yǎng)即可檢出等特點。美國杜邦公司的BAXRSystem Q7病原微生物快速檢測系統(tǒng)是利用熒光定量PCR技術(shù)篩選樣品中的致病菌的檢測系統(tǒng)，優(yōu)點在于特異性強，假陽性率低，耗時短，增菌液直接檢測無需純培養(yǎng)，檢測效率高[12]。

2.5 R iboPrinter鑒定結(jié)果

將確定是沙門氏菌的菌株用全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（R iboPrinter）進行菌種鑒定，CODE028和CODE069均檢出鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）。具體結(jié)果見表5。

表5 RiboPrinter菌種鑒定結(jié)果Table 5 Strain identification results of RiboPrinter

3 結(jié)論

本次試驗通過miniVIDAS檢測和BAXRSystem Q7病原微生物快速檢測系統(tǒng)檢測與國標方法結(jié)果一致，血清學(xué)分型要求實驗人員有豐富的經(jīng)驗，可借助儀器鑒定結(jié)果進一步驗證，本次試驗利用R iboPrinter系統(tǒng)進行菌種鑒定，結(jié)果和血清分型的結(jié)果一致。也可以采用 MLST、PFGE、MALDI-TOF MS、全自動 rR NA基因指紋（核糖體分型）技術(shù)等多種分型技術(shù)參與驗證[13-15]，目前從分子水平進行細菌的鑒定鑒別是食源性細菌鑒定分型的趨勢，建議使用多種方法如免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法等進行平行試驗，各種方法相互驗證，使結(jié)果準確可靠。