響應(yīng)面法優(yōu)化改性制備低溶點(diǎn)、軟凝膠瓊脂

童金華，劉曉婷，安鳳平，黃群，滕慧，宋洪波，*

（1.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

瓊脂，又稱(chēng)瓊膠、凍粉，是一種從紅藻類(lèi)海藻中提 取的天然多糖膠體。瓊膠具有優(yōu)良的凝膠、增稠和穩(wěn)定性能，可用作增稠劑、凝固劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、生物培養(yǎng)基和微生物載體，廣泛應(yīng)用于食品、日用化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-2]，傳統(tǒng)工藝制備的瓊脂需95℃～100℃溶解成為均一的膠體溶液[1，3]。有別于傳統(tǒng)較高凝膠強(qiáng)度的瓊脂產(chǎn)品，具備低溫溶解、軟凝膠的瓊脂，可廣泛應(yīng)用于酸奶、冰淇淋、飲料等的生產(chǎn)中[4]，市場(chǎng)需求旺盛。目前該類(lèi)產(chǎn)品主要依賴(lài)進(jìn)口。

本研究采用螺桿擠壓與羧甲基化相結(jié)合對(duì)市售瓊脂進(jìn)行改性，制備低溶點(diǎn)、軟凝膠瓊脂，并使用核磁共振及掃描電鏡技術(shù)初步探討改性機(jī)理，為生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓊脂：福建綠新食品有限公司。氯乙酸（分析純）：天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸、無(wú)水乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DS32-ⅢB型雙螺桿擠壓機(jī)：濟(jì)南賽信機(jī)械有限公司；HH-6型恒溫水浴鍋：金壇市雙捷試驗(yàn)儀器廠；101-0型鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海陽(yáng)光試驗(yàn)儀器有限公司；FZl02型微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；NG1指針型凝膠強(qiáng)度測(cè)定儀：中國(guó)科學(xué)院海洋研究所；BS124S型電子分析天平、TE612-L型電子天平、PB-10 pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；ADVANCE III HD 400M型核磁共振儀：瑞士布魯克公司；JSM-6380 LV型掃描電鏡：日本JEOL公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 改性瓊脂制備工藝

預(yù)處理：采用螺桿擠壓機(jī)預(yù)處理瓊脂粉，螺桿擠壓處理工藝條件為：水料比1∶2（mL/g）、溫度115℃、螺桿轉(zhuǎn)速80 r/min；40℃恒溫干燥24 h，粉碎后過(guò)80目篩，得預(yù)處理瓊脂粉。

羧甲基化改性：取10.00 g預(yù)處理瓊脂粉，加入100 mL不同濃度的乙醇溶液并攪拌使預(yù)處理瓊脂粉均勻分散，分別加入4 mL濃度為20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氫氧化鈉溶液至反應(yīng)體系中至氫氧化鈉濃度為0.8%，35℃水浴保溫1 h；加入一定量的氯乙酸鈉溶液（由氯乙酸與等摩爾比的20%氫氧化鈉水溶液中和得到），以一定溫度反應(yīng)3 h后，冷卻至室溫；用1 mol/L醋酸調(diào)節(jié)pH至7.0，抽濾后用相應(yīng)濃度的乙醇溶液洗滌濾餅3次，收集濾餅；40℃恒溫干燥24 h，粉碎過(guò)篩得改性瓊脂粉末[5]。

1.2.2 羧甲基化改性的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇氯乙酸鈉添加量（A）、羧甲基化反應(yīng)溫度（B）、乙醇濃度（C）為考察因素，以溶解溫度（Y1）、凝膠強(qiáng)度（Y2）為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化羧甲基化改性瓊脂工藝。因素及水平如表1所示。

1.2.3 溶解溫度及凝膠強(qiáng)度測(cè)定

用25 mL試管配制1%濃度的膠液于恒溫水浴鍋中進(jìn)行溶解，設(shè)定預(yù)估溶解溫度，每30分鐘上調(diào)1℃直至溶解，記錄溶解的溫度[6]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels for response surface experiments

凝膠強(qiáng)度測(cè)定：將凝膠樣品置于凝膠強(qiáng)度測(cè)定儀試樣座上，首先記錄表盤(pán)的初始數(shù)值；打開(kāi)開(kāi)關(guān)，記錄凝膠瞬間破裂時(shí)表盤(pán)的數(shù)值，兩個(gè)數(shù)值之差即為凝膠強(qiáng)度[7]。

1.2.4 核磁共振檢測(cè)

將瓊脂置于研缽中研磨，將研磨好的粉末裝入4mm的樣品管。采用核磁共振儀對(duì)樣品進(jìn)行13C-核磁共振（13C-nuclear magnetic resonance，13C-NMR）譜測(cè)定。

1.2.5 掃描電鏡測(cè)定

將瓊脂粉末粘在導(dǎo)電膠帶上，在真空（真空度為20 Pa）條件下噴金處理，再固定在載物臺(tái)上，用LEO1530掃描電子顯微鏡以不同放大倍數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行觀察，并拍攝照片[8]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 10軟件進(jìn)行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化羧甲基化瓊脂

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)及模型建立

以氯乙酸鈉添加量（A）、羧甲基化反應(yīng)溫度（B）、乙醇濃度（C）為考察因素，以溶解溫度（Y1）、凝膠強(qiáng)度（Y2）為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化羧甲基化改性瓊脂工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface method

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results for response surface method

對(duì)表2中的溶解溫度進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 溶解溫度方差分析表Table 3 Variance analysis for solution temperature

對(duì)表2中溶解溫度（Y1）與氯乙酸鈉添加量（A）、羧甲基化反應(yīng)溫度（B）、乙醇濃度（C）擬合得到二次多項(xiàng)式方程如式（1）：

從表3可知，式（1）的顯著性檢驗(yàn)P<0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)=0.37>0.05，不顯著，表明該型是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應(yīng)溫度、乙醇濃度的一次項(xiàng)對(duì)溶解溫度影響極顯著（P＜0.01），氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應(yīng)溫度的二次項(xiàng)對(duì)溶解溫度影響極顯著（P＜0.01），3個(gè)因素的兩兩交互作用的影響均顯著（P＜0.05）。

根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)凝膠強(qiáng)度（Y2）與3個(gè)因素關(guān)系進(jìn)行擬合得二次多項(xiàng)式方程如式（2）。

表4 是對(duì)表2中凝膠強(qiáng)度的方差分析結(jié)果。

表4 凝膠強(qiáng)度方差分析表Table 4 Variance analysis for gel strength

由表4可知，方程（2）極顯著。氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應(yīng)溫度、乙醇濃度的一次項(xiàng)對(duì)凝膠強(qiáng)度影響均極顯著，羧甲基化反應(yīng)溫度、乙醇濃度二次項(xiàng)的影響分別達(dá)到顯著和極顯著，氯乙酸鈉添加量和羧甲基化反應(yīng)溫度交互作用顯著，氯乙酸鈉添加量和乙醇濃度、羧甲基化反應(yīng)溫度和乙醇濃度交互作用的影響極顯著。

2.1.2 響應(yīng)面分析

氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應(yīng)溫度和乙醇濃度與瓊脂溶解溫度及凝膠強(qiáng)度關(guān)系的響應(yīng)面分別如圖1和圖2所示。

從圖1和圖2可以看出，氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應(yīng)溫度、乙醇濃度3個(gè)因素與瓊脂溶解溫度、凝膠強(qiáng)度均呈負(fù)相關(guān)；3個(gè)因素的兩兩交互作用對(duì)溶解溫度和凝膠強(qiáng)度的影響均顯著或極顯著，氯乙酸鈉添加量和羧甲基化反應(yīng)溫度的二次項(xiàng)對(duì)溶解溫度的影響極顯著，羧甲基化反應(yīng)溫度、乙醇濃度的二次項(xiàng)對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響較顯著，與表3和表4的分析結(jié)果一致。

2.1.3 最佳工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

圖1 交互作用對(duì)瓊脂溶解溫度的影響Fig.1 Effects of cross-interaction on solution temperature

對(duì)于低溶點(diǎn)瓊脂而言，溶解溫度是最重要的考察指標(biāo)，同時(shí)兼顧較低的凝膠強(qiáng)度，因此設(shè)定溶解溫度范圍為（52±1）℃、兼顧凝膠強(qiáng)度范圍為55 g/cm2～60 g/cm2，采用方程（1）對(duì)羧甲基化改性瓊脂工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的工藝參數(shù)為：氯乙酸鈉添加量0.027 mol、羧甲基化反應(yīng)溫度52.5℃、乙醇濃度73.7%，預(yù)測(cè)的溶解溫度為55.7℃。為了方便操作，調(diào)整后的工藝參數(shù)為：氯乙酸鈉添加量0.027 mol、羧甲基化反應(yīng)溫度53.0℃、乙醇濃度74.0%，采用公式（1）預(yù)測(cè)的溶解溫度為55.7℃，采用公式（2）預(yù)測(cè)的凝膠強(qiáng)度為58.5 g/cm2；驗(yàn)證試驗(yàn)表明，改性瓊脂的溶解溫度為（55.4±0.4）℃、凝膠強(qiáng)度為（58.6±1.2）g/cm2，實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值接近。

與未改性瓊脂溶解溫度為95.2℃、凝膠強(qiáng)度為1 554 g/cm2相比，改性瓊脂的溶解溫度及凝膠強(qiáng)度均大幅度降低，具體優(yōu)良的低溶點(diǎn)、軟凝膠特性。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

根據(jù)核磁共振波譜圖中顯示的共振峰的位置、峰的強(qiáng)度及其精細(xì)結(jié)構(gòu)，可推算出所測(cè)定的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[9-10]。未改性瓊脂和改性瓊脂的核磁共振圖譜分別如圖3和圖4所示。

圖2 交互作用對(duì)瓊脂凝膠強(qiáng)度的影響Fig.2 Effects of cross-interaction on gel strength

圖3 未改性瓊脂核磁共振圖譜Fig.3 13C-NMR spectra of unmodified agar

圖4 改性瓊脂核磁共振圖譜Fig.4 13C-NMR spectra of modified agar

與圖3所示未改性瓊脂13C-NMR圖譜的相比，從圖4改性瓊脂的13C－NMR圖譜觀察到δ=176.3處出現(xiàn)了很微弱的新吸收峰，這是－CH2COO－的羧基基團(tuán)特征的化學(xué)位移，表明改性使得－CH2COO－被引入到瓊脂的分子中[11－12]；改性瓊脂中C－1原子的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)了4 ppm～5 ppm這說(shuō)明D－半乳糖單元C－1原子上的羥基發(fā)生了羧甲基取代，而原有的結(jié)構(gòu)未遭到破壞。

掃描電鏡（scanning electron microscope）有制樣簡(jiǎn)單、圖像分辨率高、放大倍數(shù)可調(diào)范圍寬、景深大等特點(diǎn)，可以觀察樣品表面細(xì)微形態(tài)，以便于獲得所測(cè)物質(zhì)細(xì)微的結(jié)構(gòu)特征[13－14]。未改性及改性瓊脂的掃描電鏡圖見(jiàn)圖5。

圖5 未改性及改性瓊脂的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopy figures of unmodified and modified agar

如圖5所示，未改性瓊脂顆粒表面較為光滑且平整，顆粒呈片狀；改性瓊脂顆粒為不規(guī)則的塊狀且表面粗糙，呈現(xiàn)較多不規(guī)則斷裂面。由于經(jīng)螺桿擠壓后羧甲基改性，使得瓊脂顆粒形態(tài)一定程度破壞，顆粒表面積增大，因此更有利于改性瓊脂吸水膨脹和溶解。

3 結(jié)論

1）經(jīng)螺桿擠壓預(yù)處理后進(jìn)行羧甲基化改性瓊脂，優(yōu)化的羧甲基化工藝參數(shù)為：氯乙酸鈉添加量0.027mol、羧甲基化反應(yīng)溫度53.0℃、乙醇濃度74%，制備的改性瓊脂的溶解溫度為55.4℃、凝膠強(qiáng)度為58.6 g/cm2，表現(xiàn)出優(yōu)良的低溫溶解和軟凝膠性能。

2）核磁共振分析表明經(jīng)改性的瓊脂，羧甲基官能團(tuán)被成功引入到瓊脂的糖單元結(jié)構(gòu)中，但原有結(jié)構(gòu)未破壞；掃描電鏡觀察表明改性使得瓊脂顆粒受到一定程度破壞，顆粒表面積增大；這些化學(xué)及物理結(jié)構(gòu)的變化，為良好的低溶點(diǎn)、軟凝膠性能提供了保障。