金花茶多酚微膠囊的制備及其特性研究

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004）

金花茶（Camellia Chrysantha（Hu）Tuyama）是山茶科、山茶屬、金花茶組植物，世界上著名的觀賞植物之一，因其珍貴性和稀有性，被譽(yù)為“茶族皇后”和“植物界的大熊貓”[1]。近年來(lái)，隨著研究技術(shù)的發(fā)展和人們保健意識(shí)的提升，金花茶的價(jià)值正被逐漸開發(fā)并廣泛應(yīng)用，它不僅能調(diào)節(jié)血糖血脂、提高機(jī)體免疫力，而且在抗癌、抗氧化以及抗衰老方面也表現(xiàn)出極高的藥用價(jià)值，是一種優(yōu)良的保健食品原材料[2]。

金花茶多酚是使金花茶具有營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值的重要活性成分[3]。目前對(duì)金花茶多酚的研究主要集中在含量測(cè)定和提取工藝方面。王坤等[4]在采用福林-酚法測(cè)定茶多酚時(shí)發(fā)現(xiàn)，金花茶的品種不同所含的茶多酚的量就會(huì)具有明顯差異，其中越南厚葉金花茶的茶多酚含量最多，高達(dá)11.71%。牛廣俊等[5]采用乙醇提取法從金花茶花中提取茶多酚等活性物質(zhì)并進(jìn)行工藝優(yōu)化，總多酚提取率到達(dá)6.25%。然而，茶多酚自身存在的一些缺陷大大限制了其應(yīng)用范圍，如脂溶性較差[6]、易受光和溫度的氧化破壞[7]、在腸胃中結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定[8]等等。為解決這類問題，通常采用微膠囊技術(shù)來(lái)提高茶多酚的穩(wěn)定性[9]，如噴霧干燥法、復(fù)相乳化法、超臨界流體法等微膠囊技術(shù)。其中噴霧干燥法是一種工藝簡(jiǎn)單、操作靈活、生產(chǎn)過程符合環(huán)保要求的方法。且目前關(guān)于金花茶多酚微膠囊的研究較少，尚未見對(duì)其特性的研究報(bào)道。

本研究以羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯（hydroxypropyl methyl cellulose phthalate，HPMCP）為壁材，金花茶多酚原液為芯材，優(yōu)化噴霧干燥法制備金花茶多酚微膠囊工藝條件，同時(shí)對(duì)產(chǎn)品的緩釋特性、穩(wěn)定性和抗氧化性進(jìn)行研究，以期獲得較好的微膠囊產(chǎn)品，對(duì)推廣金花茶的規(guī)?；N植，促進(jìn)金花茶產(chǎn)品的開發(fā)利用以及金花茶產(chǎn)業(yè)價(jià)值的提升都有極為深遠(yuǎn)的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯：麻城市天安納米化工材料有限公司；十二烷基硫酸鈉（化學(xué)純）：東明俱進(jìn)化有限公司；胃蛋白酶、胰酶（胃蛋白酶比活≥3 000 U/g、胰酶比活≥250 NFU/mg）：北京索萊寶科技有限公司；綠茶多酚（純度95%）：上海寶曼生物科技有限公司；金花茶多酚原樣干粉、金花茶多酚提取液（純度30%）：廣西桂人堂金花茶有限公司；DPPH：FLNKA公司；鄰苯三酚：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰二氮菲：廣州化學(xué)試劑廠；以上藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；GZL25噴霧干燥器：無(wú)錫市陽(yáng)光干燥設(shè)備廠；SK-2200超聲波清洗儀：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；UV-2802H紫外可見分光光度計(jì)：上海儀器有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡：日本日立公司；RE-D2AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；722分光光度計(jì)：天津普瑞斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金花茶多酚微膠囊的制備工藝

稱取一定量的壁材（HPMCP）溶于80%的乙醇水溶液中（按照3∶100的質(zhì)量比溶解）→加入金花茶多酚提取液混勻→按芯材和壁材總重的4%加入乳化劑十二烷基硫酸鈉，混勻→高壓均質(zhì)→噴霧干燥→冷卻→微膠囊產(chǎn)品

1.3.2 酒石酸亞鐵比色法測(cè)定金花茶多酚的含量

準(zhǔn)確量取1.00 mg/mL的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，加入5 mL酒石酸亞鐵溶液，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度。用10 mm比色杯在540 nm處測(cè)定茶多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制茶多酚濃度——吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。同時(shí)做空白參比。

圖1 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve for tea polyphenol

由圖1可知，茶多酚濃度——吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 y=6.285 7x+0.002 38，R2＝0.999 3。金花茶多酚的含量即可通過測(cè)定吸光度再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到。

1.3.3 金花茶多酚微膠囊包埋率的測(cè)定[10]

1.3.3.1 產(chǎn)品表面茶多酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取金花茶多酚微膠囊1.00 g溶于一定量的水中，定容至100 mL后以3 000 r/min的速度高速離心15 min，然后吸取上清液1 mL，定容至25 mL容量瓶中，10 min后測(cè)其吸光度，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，即可得到金花茶多酚微膠囊表面的茶多酚含量。

1.3.3.2 產(chǎn)品中總茶多酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取金花茶多酚微膠囊1.00 g，先用30 mL的無(wú)水乙醇充分?jǐn)嚢枞芙獗诓?，再用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，超聲處理30 min后吸取上清液1 mL，定容至25 mL容量瓶中，10 min后測(cè)其吸光度，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，即可得到金花茶多酚微膠囊中總茶多酚含量。

1.3.3.3 計(jì)算包埋率

包埋率/%=（1-產(chǎn)品表面茶多酚含量/產(chǎn)品總茶多酚含量）×100

1.3.4 金花茶多酚微膠囊的表面顯微形態(tài)觀測(cè)

取一定量的金花茶多酚微膠囊用雙面膠固定在樣品臺(tái)上，經(jīng)鍍金處理后，置于掃描電子顯微鏡樣品室中，并進(jìn)行抽真空處理。用掃描電鏡觀察微膠囊結(jié)構(gòu)。

1.3.5 金花茶多酚微膠囊在模擬胃、腸液中釋放的測(cè)定

1.3.5.1 模擬腸液的配制

取6.8 g KH2PO4溶于500 mL水中，加入4%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，再加入10 g胰酶，混勻后定容至1 000 mL。

1.3.5.2 模擬胃液的配制

將16.4 mL稀鹽酸和10 g胃蛋白酶加到800 mL水中，攪勻后定容至1 000 mL。

1.3.5.3 模擬胃腸環(huán)境的釋放

取0.5 g金花茶多酚微膠囊置于100 mL人工腸液中，（37±0.5）℃恒溫水浴，以 300 r/min的速度攪拌，在10、20、30、60、120、180、240、300 min 時(shí)間段取樣，于544 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚含量，分析微膠囊在人工腸液中的溶出情況。通過計(jì)算累積釋放度觀察微膠囊在胃腸道中的緩釋效果。累積釋放度按下式計(jì)算：

累積釋放度/%=（最大釋放時(shí)的多酚濃度/多酚總濃度）×100

1.3.6 金花茶多酚微膠囊穩(wěn)定性測(cè)定

各取3 g金花茶多酚微膠囊和金花茶多酚原樣干粉置于敞口培養(yǎng)皿中，攤成厚度≤5 mm的薄層，室溫保存，每隔5天各取0.5 g樣品測(cè)定茶多酚含量，計(jì)算出其茶多酚保留率。試驗(yàn)時(shí)間為20 d。茶多酚保留率按下式計(jì)算：

1.3.7 金花茶多酚微膠囊抗氧化性的測(cè)定

以綠茶多酚作為對(duì)照，研究對(duì)比金花茶多酚微膠囊（試樣A）和金花茶多酚原樣干粉（試樣B）的體外抗氧化活性，測(cè)定對(duì)羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（O2-）和二苯基苦基苯肼自由基（DPPH·）的清除作用。

1.3.7.1 清除羥基自由基（·OH）能力的測(cè)定

在試管中加入2 mL pH=7.4的磷酸緩沖溶液、1 mL 1.5 mmol/L鄰二氮菲和1 mL 1.5 mmol/L FeSO4溶液混勻后，加入1 mL樣液混勻，再加入1 mL 0.02%H2O2，最后補(bǔ)充體積至8 mL，在536 nm處測(cè)吸光度A加樣；對(duì)照組以1 mL蒸餾水代替樣品溶液，其余處理同上，測(cè)定吸光度A對(duì)照，空白組則以1 mL蒸餾水代替H2O2，相同處理后測(cè)其吸光度A空白?！H清除率按下式計(jì)算：

1.3.7.2 清除二苯基苦基苯肼自由基（DPPH·）能力的測(cè)定

取2 mL試樣于試管中，再加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH·的乙醇溶液，混合均勻，0.5 h后在517 nm處測(cè)定吸光度A加樣；同時(shí)測(cè)2 mL DPPH·溶液和2 mL乙醇混合后的吸光度A對(duì)照，以及2 mL樣液和2 mL乙醇混合后的吸光度A空白。DPPH·清除率按下式計(jì)算：

1.3.7.3 清除超氧陰離子（O2-）能力的測(cè)定

取4.5 mL pH=8.2 Tris-HCl緩沖溶液，分別加入1 mL樣液，25℃保溫20 min后加入0.3 mL 1 mmol鄰苯三酚啟動(dòng)反應(yīng)，5 min后測(cè)定325 nm處的吸光度A加樣，同時(shí)設(shè)置對(duì)照（加入4.2 mL的蒸餾水代替樣液）和空白（用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液）。O2-清除率按下式計(jì)算：

2 結(jié)果分析

2.1 金花茶多酚微膠囊制備的工藝優(yōu)化

在噴霧干燥法制備金花茶多酚微膠囊的過程中，存在很多影響產(chǎn)品質(zhì)量的因素。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，選擇進(jìn)風(fēng)溫度（A）、進(jìn)料速度（B）、芯材壁材質(zhì)量比（C）以及總固形物含量（D）為考察因素，以包埋率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)金花茶多酚微膠囊的制備進(jìn)行工藝優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 金花茶多酚微膠囊微制備的正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment of camellia polyphenols microsphere preparation

表2 金花茶多酚微膠囊制備的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The test results of camellia polyphenols microsphere preparation

由表2可知，各因素影響包埋率的主次順序?yàn)椋築>C>A>D，即進(jìn)料速度對(duì)包埋率的影響最大，其次是芯材壁材配比和進(jìn)風(fēng)溫度，影響最小的是總固形物含量。各因素的最優(yōu)水平為A2B3C3D1，即制備金花茶多酚微膠囊的最佳工藝條件為：進(jìn)風(fēng)溫度100℃，進(jìn)料速度6.4 mL/min，芯材壁材配比2∶1，總固形物含量2%。在最佳制備工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，包埋率達(dá)到80.35%。

噴霧干燥時(shí)的進(jìn)風(fēng)溫度會(huì)影響干燥過程，從而影響微膠囊產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)[11]。進(jìn)風(fēng)溫度過高會(huì)導(dǎo)致水分散失過快，使壁材表面皸裂，從而降低得率，但溫度過低又會(huì)使微膠囊顆粒水分含量過多，粘壁現(xiàn)象嚴(yán)重，因此在制備過程中應(yīng)將進(jìn)風(fēng)溫度應(yīng)控制在一個(gè)合理的范圍內(nèi)。而在進(jìn)風(fēng)溫度為100℃時(shí)制得的微膠囊產(chǎn)品表征較好，因此本試驗(yàn)選定進(jìn)風(fēng)溫度為100℃。進(jìn)料速度的改變會(huì)影響霧滴直徑的大小和水分含量的多少，從而影響霧化效果和微膠囊產(chǎn)品質(zhì)量[12]。當(dāng)進(jìn)料速度為4.8 mg/mL時(shí)，蒸發(fā)過度，存在芯材損失現(xiàn)象，且生產(chǎn)效率較低，因此應(yīng)進(jìn)一步提高進(jìn)料速度，所以本試驗(yàn)選擇的進(jìn)料速度為6.4 mg/mL。壁材的選擇會(huì)對(duì)制備的微膠囊產(chǎn)品產(chǎn)生極大影響，本研究選擇HPMCP作為壁材。HPMCP是一種性能優(yōu)良的腸溶性材料，溶解速度快，穩(wěn)定性高，且安全無(wú)毒，是一種理想的微膠囊壁材。而芯材與壁材的配比會(huì)對(duì)包埋率產(chǎn)生極大影響，隨著芯材與壁材配比的減小，成膜率相應(yīng)增加，會(huì)使芯材損失降低；但過量的壁材又會(huì)延長(zhǎng)霧化時(shí)間，使得芯材損失增加[13]。當(dāng)芯材壁材質(zhì)量比為1∶1時(shí)霧化效果已不甚理想，因此選取芯材壁材的配比為2∶1?？偣绦挝锖康亩嗌贂?huì)影響乳液的穩(wěn)定性。隨著固形物含量的增加，體系穩(wěn)定性相應(yīng)增加，成膜性也會(huì)相應(yīng)提高[14]，但當(dāng)固形物含量達(dá)到5%時(shí)已有粘壁現(xiàn)象出現(xiàn)，達(dá)到8%時(shí)即開始影響噴霧干燥過程，成膜率降低。因此綜合考慮，本試驗(yàn)將總固形物含量控制在2%。

2.2 金花茶多酚微膠囊的表面顯微形態(tài)

用掃描電子顯微鏡在放大200倍的條件下可以較好的觀察到金花茶多酚微膠囊的表面結(jié)構(gòu)見圖2、圖3。

圖2 金花茶多酚微膠囊電鏡圖（200×）Fig.2 Camellia polyphenols microsphere figures of SEM（200×）

圖3 金花茶多酚原樣干粉電鏡圖（200×）Fig.3 Camellia polyphenols sample microsphere figures of SEM（200×）

由圖2可知，在最優(yōu)工藝條件下，噴霧干燥法制得的金花茶多酚微膠囊顆粒完整，為大致規(guī)則的球形，粒徑大約在20 μm～50 μm；而圖3中金花茶多酚原樣干粉出現(xiàn)粘連現(xiàn)象，分散性較差。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，金花茶多酚微膠囊具有較好的包埋效果。

2.3 金花茶多酚微膠囊在模擬胃、腸液中的釋放

金花茶多酚微膠囊在人工胃、腸液中的溶出情況如圖4所示。

圖4 金花茶多酚微膠囊在模擬腸、胃液中的釋放曲線Fig.4 The release curve of camellia polyphenols microsphere of the simulated gastric and colonic fluid

由圖4可知，在人工胃液中金花茶多酚濃度最大值出現(xiàn)在120 min左右，約為0.51 mg/mL。在人工腸液中，10 min時(shí)出現(xiàn)突釋現(xiàn)象，金花茶多酚濃度迅速上升到1.18 mg/mL，之后的2小時(shí)內(nèi)濃度能基本維持在1 mg/mL，并在60 min左右達(dá)到最大值1.19 mg/mL。說(shuō)明所得的微膠囊產(chǎn)品具有較好的緩釋效果。計(jì)算可知金花茶多酚微膠囊最大累積釋放度達(dá)到88.42%。

2.4 金花茶多酚微膠囊穩(wěn)定性測(cè)定

金花茶多酚微膠囊和金花茶多酚原樣干粉在貯藏期間的茶多酚保留率變化情況見圖5。

圖5 放置時(shí)間與金花茶多酚保留率的關(guān)系Fig.5 Relationship between standing time and camellia polyphenols retention rate

由圖5可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，金花茶多酚保留率整體呈明顯的下降趨勢(shì)，且原樣干粉的下降趨勢(shì)更為急劇。在20天時(shí)，微膠囊所含金花茶多酚的保留率為81.23%，而原樣干粉的保留率僅為45.56%，說(shuō)明HPMCP微膠囊化對(duì)內(nèi)部芯材的保護(hù)效果比較理想，能夠有效提升金花茶多酚的穩(wěn)定性。

2.5 金花茶多酚微膠囊抗氧化性測(cè)定

2.5.1 對(duì)·OH的清除

以綠茶多酚作為陽(yáng)性對(duì)照，按照1.3.7.1測(cè)定試樣A和試樣B對(duì)·OH的清除能力，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 不同試樣對(duì)·OH的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of samples on·OH

由圖6可知，試樣清除·OH的能力呈現(xiàn)明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。樣品濃度在5 mg/mL以下時(shí)，隨濃度的增大清除率具有明顯的上升趨勢(shì)，到達(dá)5 mg/mL以后，上升趨勢(shì)比較緩慢。這是因?yàn)樵嚇又泻械墓潴w在高濃度時(shí)將反應(yīng)Fe2++H2O2→Fe3++OH+·OH中的Fe2+被氧化成Fe3+，促使·OH生成，從而使得清除率降低[15]。但3種樣品對(duì)·OH的清除率仍處于較高水平，試樣B的清除能力與綠茶多酚相當(dāng)，略高于試樣A。

2.5.2 對(duì)DPPH·的清除

以綠茶多酚作為陽(yáng)性對(duì)照，按照1.3.7.2測(cè)定試樣A和試樣B對(duì)DPPH·的清除能力，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 不同試樣對(duì)DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of samples on DPPH·

從圖7可以看出，試樣A、B的清除能力與綠茶多酚效果相當(dāng)，在濃度低于0.5 mg/mL時(shí)甚至比綠茶多酚的效果更好。試樣B的清除效果略高于試樣A，但相差不大。3種樣品對(duì)DPPH·的清除效果都比較理想。

2.5.3 對(duì)O2－的清除

以綠茶多酚作為陽(yáng)性對(duì)照，按照1.3.7.3測(cè)定試樣A和試樣B對(duì)O2－的清除能力，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 不同試樣對(duì)O2-的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of samples on O2-

由圖8可知，當(dāng)濃度小于1 mg/mL時(shí)，綠茶多酚和試樣A、B都對(duì)O2-出現(xiàn)負(fù)清除作用?？赡苁且?yàn)樵嚇又泻朽彵饺咏Y(jié)構(gòu)，會(huì)發(fā)生自氧化，從而產(chǎn)生大量的O2-，使檢測(cè)呈現(xiàn)負(fù)清除[16]。但隨著濃度的增加清除率逐漸上升并達(dá)到較高水平，試樣A和B對(duì)O2-的清除能力都高于綠茶多酚。

3 結(jié)論

以HPMCP為壁材、金花茶多酚原液為芯材制備金花茶多酚微膠囊，并通過正交試驗(yàn)對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到噴霧干燥法制備金花茶多酚微膠囊的最佳工藝條件為：進(jìn)風(fēng)溫度100℃，進(jìn)料速度6.4 mL/min，芯壁材質(zhì)量比2∶1，總固形物含量2%。在此條件下包埋率可達(dá)到80.35%。

通過掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)金花茶多酚微膠囊分布均勻，顆粒圓整，分散性較好。通過模擬胃腸液環(huán)境可知，金花茶多酚微膠囊具有較好的緩釋效果，最大累積釋放度達(dá)到88.42%。以金花茶多酚原樣干粉為對(duì)照，放置一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)HPMCP微膠囊化對(duì)內(nèi)部芯材的保護(hù)效果比較理想，所含茶多酚的保留率可達(dá)到81.23%。以綠茶多酚作為陽(yáng)性對(duì)照，利用3種不同的體系探討金花茶多酚微膠囊的抗氧化活性，結(jié)果表明金花茶多酚微膠囊清除·OH、O2-、DPPH·的能力與綠茶多酚以及金花茶多酚原樣干粉相當(dāng)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。