羊胚胎移植技術(shù)及其應(yīng)用

瞿靜雯　尹修遠(yuǎn)　李擁軍

摘要 胚胎移植，又稱(chēng)借腹懷胎、受精卵移植，是通過(guò)超數(shù)排卵技術(shù)獲得品種優(yōu)良母畜的早期胚胎，同時(shí)對(duì)受體母畜進(jìn)行同期發(fā)情處理，使其處于發(fā)情期的同一階段，將早期胚胎移植到生理狀態(tài)相同的受體母畜生殖道或子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成獨(dú)立個(gè)體的生物繁殖技術(shù)。胚胎移植是繼人工授精技術(shù)之后的又一項(xiàng)加快家畜擴(kuò)大繁殖的先進(jìn)技術(shù)，幾十年來(lái)在羊純種繁殖和快速擴(kuò)繁等生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。本文就羊胚胎移植中的技術(shù)環(huán)節(jié)及其應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行討論，以期對(duì)該項(xiàng)技術(shù)在生產(chǎn)中的規(guī)范應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 胚胎移植；羊；技術(shù)環(huán)節(jié)；應(yīng)用現(xiàn)狀

中圖分類(lèi)號(hào) S814.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）16-0205-03

Technology and Application of Sheep Embryo Transfer

QU Jing-wen 1，2 YIN Xiu-yuan 1，2 LI Yong-jun 1，2 * GUO Hai-yan 1，2 WANG Qiang 1，2

（1 Animal Science and Technology College，Yangzhou University，Yangzhou Jiangsu 225009； 2 Key Laboratory for Animal Genetic，Breeding，Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province）

Abstract Embryo transfer，which called abdominal pregnancy and transplant fertilized eggs，is the early embryo of superior female by superovulation technology.At the same time，the recipient females are processed to make them in the same stage of estrus.The early embryos are transplanted to the genital tract or womb of the same receptor female in the same state physiological status，allowing them to continue to develop into individual.Embryo transfer is another advanced technology that accelerates the expansion of livestock after artificial insemination technology，which has been widely used in sheep breeding and rapid propagation in the past decades.This paper discussed the technical process of sheep embryo transfer and its application status，so as to provide some theoretical guidances for the standardized application of the technology in production.

Key words embryo transfer；sheep；technical process；application status

胚胎移植技術(shù)是基于人類(lèi)對(duì)哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生、發(fā)育、繁殖規(guī)律的認(rèn)識(shí)，通過(guò)大量的試驗(yàn)研究和生產(chǎn)應(yīng)用，逐漸發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)先進(jìn)的生物技術(shù)[1]。早在1890年，Walter Heape教授在英國(guó)劍橋大學(xué)首次通過(guò)胚胎移植成功使比利時(shí)母兔產(chǎn)出了安哥拉仔兔[2]，這一舉措引起了廣泛關(guān)注。隨后，以家兔、鼠為研究對(duì)象的胚胎移植技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，但以牛、羊等草食性動(dòng)物為研究對(duì)象的胚胎移植技術(shù)起步較晚。

我國(guó)胚胎移植技術(shù)的研究和應(yīng)用起步較晚，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，我國(guó)胚胎移植技術(shù)都處于試驗(yàn)階段。直到20世紀(jì)60年代，家兔胚胎移植技術(shù)才獲得成功，隨后這一技術(shù)在豬、馬、牛、羊等中大型家畜上應(yīng)用也成功獲得后代，這對(duì)加快良種化進(jìn)程、加速擴(kuò)繁、品種選育和品種培育等繁殖技術(shù)起到重要作用[3]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，肉羊產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出欣欣向榮的景象，社會(huì)需求量的增加，對(duì)優(yōu)質(zhì)種羊的需求也進(jìn)一步增加，少量進(jìn)口的優(yōu)質(zhì)種羊難以滿(mǎn)足市場(chǎng)的需要。因此，胚胎移植技術(shù)亟須得到廣泛應(yīng)用。

本文闡述了羊胚胎移植過(guò)程中的技術(shù)環(huán)節(jié)及應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為提高母羊繁殖力提供一定的借鑒，使我國(guó)的肉羊產(chǎn)業(yè)更快地向商業(yè)化方向邁進(jìn)。

1 技術(shù)環(huán)節(jié)

1.1 供體羊和受體羊的選擇

1.1.1 供體。選擇的供體羊應(yīng)具有品種優(yōu)良、生產(chǎn)性能好、遺傳性穩(wěn)定及無(wú)不良遺傳疾病和傳染性疾病等優(yōu)點(diǎn)。此外，供體羊應(yīng)選擇繁殖機(jī)能正常，已證明對(duì)超數(shù)排卵反應(yīng)較好的母羊，年齡以2～5歲為宜，青年羊應(yīng)在8月齡以上[4]。

1.1.2 受體。選擇的受體羊應(yīng)健康、繁殖性能良好、無(wú)不良遺傳或傳染性疾病、母性好、產(chǎn)奶量高、體型較大的母羊，年齡1～5歲，以產(chǎn)過(guò)1～3胎為宜。受體羊的年齡應(yīng)與供體山羊較為接近，相差1歲之內(nèi)為宜，供體羊與受體羊的比例為1∶15～20。

1.2 供體的超數(shù)排卵

在母畜發(fā)情的適當(dāng)時(shí)期，一般在發(fā)情后期，通過(guò)注射外源促性腺激素，使母畜卵巢比自然發(fā)情時(shí)有更多的卵泡發(fā)育并排出的過(guò)程，稱(chēng)為超數(shù)排卵。羊一般通過(guò)以下幾種方法進(jìn)行超數(shù)排卵。

1.2.1 FSH+LH法。發(fā)情周期的14～16 d任意一天開(kāi)始，連續(xù)3 d，每天2次，間隔12 h，遞減肌肉注射FSH，最后一次注射FSH后12 h肌肉注射LH，24 h后試情配種。有研究表明，F(xiàn)SH總劑量在7.5～11.5 mg/只、LH劑量在200 IU/只時(shí)超排效果較好[5]。

1.2.2 FSH+PG法。發(fā)情周期的14～16 d任意一天開(kāi)始，連續(xù)3 d，每天2次，間隔12 h，遞減肌肉注射FSH，總劑量為7.5～11.5 mg/只，最后一次注射FSH的同時(shí)注射PGF2α 2 mL，注射FSH后1～2 d即發(fā)情排卵。試情配種或輸精2次，每次間隔12 h，同時(shí)注射LH 100～150 IU，增加受精率[6]。

1.2.3 FSH+CIDR法。在發(fā)情周期14～16 d的任意一天給供體羊使用進(jìn)口CIDR陰道埋置，以此日為第1天，從第14天開(kāi)始連續(xù)3 d，每天2次，等量注射FSH，每次2 mL，在最后一次注射FSH時(shí)取出CIDR，取出后1～2 d即發(fā)情排卵。試情配種或輸精2次，每次間隔12 h，在第0天和最后1 d配合注射孕酮2 mL[7]，增加受精率。

1.3 受體的同期發(fā)情

綿羊和山羊同期發(fā)情方法相同，只是劑量上存在差別。同期發(fā)情的方法包括延長(zhǎng)黃體期和縮短黃體期2種方法。其中，延長(zhǎng)黃體期法是孕激素通過(guò)抑制卵泡期的到來(lái)而延長(zhǎng)黃體期，在合適的時(shí)間同時(shí)停止使用外源激素，而達(dá)到同期發(fā)情的效果。處理方法有皮下埋植、孕激素陰道栓法、口服法等。而縮短黃體期法是前列腺素通過(guò)溶解黃體降低孕酮水平，人為終止黃體期，使受體母羊提前發(fā)情排卵而達(dá)到同期發(fā)情的效果[7]，發(fā)情同步差在24 h之內(nèi)。

1.3.1 皮下埋植。將3 mg甲基炔諾酮裝入多孔的塑料細(xì)管中，利用套管針或?qū)ｉT(mén)的埋植器埋于母羊耳背皮下，可在埋植之前注射2～4 mg雌二醇加速自然黃體的消退，經(jīng)過(guò)數(shù)天后取出，過(guò)2～3 d即可發(fā)情[8]。皮下埋植法操作簡(jiǎn)單、高效、成本低。

1.3.2 孕激素陰道栓法。羊同期發(fā)情中以陰道栓法最為常見(jiàn)。取3 mg甲基炔諾酮溶解于色拉油中，用海綿浸潤(rùn)，在發(fā)情周期的任意一天，利用陰道擴(kuò)張器，將浸入孕激素溶液中的海綿送入陰道，細(xì)繩暴露在陰門(mén)外，14～16 d后拉住細(xì)繩將海綿栓取出，2～3 d后即可發(fā)情排卵。為了提高發(fā)情率，取出海綿栓后肌肉注射一定量前列腺素[9]。

1.3.3 口服。每日將12 mg甲地孕酮均勻拌于每頭發(fā)情母羊所食用的飼料中，保證采食后連續(xù)投喂數(shù)天，綿羊14～16 d，山羊18～20 d，停藥不久即會(huì)發(fā)情[10]。

1.3.4 前列腺素法。前列腺素法為最簡(jiǎn)單的同期發(fā)情方法，在繁殖季節(jié)使用效果最佳。肌肉注射進(jìn)行同期發(fā)情，使用二次注射法，每次劑量為10～20 mg，2次間隔時(shí)間為11～12 d。大量研究表明，一次注射法同期發(fā)情效果不明顯[11]。生產(chǎn)上常使用氯前列腺烯醇進(jìn)行發(fā)情處理。

1.4 胚胎的收集

胚胎的采集是胚胎移植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)技術(shù)之一，羊胚胎移植通常在桑葚胚至囊胚期進(jìn)行胚胎收集和移植。胚胎收集時(shí)間要根據(jù)胚胎發(fā)育情況來(lái)確定，一般在配種后3～4 d發(fā)育至桑葚胚，6～7 d發(fā)育至囊胚期。胚胎收集分為手術(shù)法和非手術(shù)法2種。在綿羊、山羊中，由于試驗(yàn)動(dòng)物子宮角特殊的解剖結(jié)構(gòu)，常使用手術(shù)法進(jìn)行采胚。

1.4.1 手術(shù)法。供體母羊沖胚前禁水、禁食12～24 h[12]。手術(shù)在手術(shù)室進(jìn)行，維持手術(shù)室溫度在20 ℃左右，肌肉注射2%靜松靈0.5～0.8 mL進(jìn)行麻醉[13]，所有手術(shù)器材都應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌處理。將供體羊仰臥保定，使之呈前低后高的狀態(tài)，沿腹中線(xiàn)兩側(cè)離乳頭2.5 cm左右處進(jìn)行刮毛處理，用碘酒棉球進(jìn)行術(shù)部消毒后做一切口，切口大小以能拉出子宮角和輸卵管為宜[14]。

當(dāng)確定受精卵還處于輸卵管時(shí)，用帶有磨鈍針頭的無(wú)菌注射器刺入子宮角尖端，每側(cè)輸卵管沖胚液用量10 mL左右，從輸卵管傘部接取胚胎液。當(dāng)確定所有受精卵已進(jìn)入子宮角內(nèi)時(shí)，用止血鉗在子宮角基部穿孔，插入沖胚管，注入適當(dāng)空氣，使氣囊封阻子宮腔為宜；然后用無(wú)菌注射器注入沖胚液30～50 mL，再由此導(dǎo)出胚胎液，兩側(cè)子宮角沖胚完畢后，放出一部分氣體，將沖胚管抽至子宮體內(nèi)，用10 mL無(wú)菌注射器注入溶解有320萬(wàn)IU青霉素和100萬(wàn)IU鏈霉素的生理鹽水10 mL，沖胚完畢后逐層縫合，將子宮體送入腹腔，防止發(fā)生子宮黏連。沖胚后2 d肌肉注射前列腺素0.4～0.6 mg以溶解卵巢上的黃體，以便下次發(fā)情周期的發(fā)生[15]。

1.4.2 非手術(shù)法。將供體羊伏臥保定在保定架上，使之呈前低后高的狀態(tài)，于外陰部周?chē)裘?、洗凈、消毒，?.05%新潔爾滅溶液沖洗陰道，排凈洗液（其他所用器械均按常規(guī)消毒）。借助開(kāi)腟器，用人醫(yī)用的子宮頸鉗夾住子宮頸口的凸起皺褶，將子宮頸緩慢向外牽引至陰門(mén)附近，由助手固定子宮頸鉗，術(shù)者將左手食指深入陰道，右手持預(yù)先套好導(dǎo)管的探針（導(dǎo)管由獸用中號(hào)套管針改制，探針由人醫(yī)用子宮探針或膽囊探針改制），使前端稍呈彎曲，在左手食指輔助下，沿著子宮頸管螺旋形的內(nèi)腔緩慢向深處插入。套有導(dǎo)管的探針通過(guò)整個(gè)子宮頸管后（深5～8 cm，阻力消失），即將探針略偏向一側(cè)繼續(xù)推進(jìn)2～3 cm。拔出探針，從導(dǎo)管內(nèi)插入采卵管（用人醫(yī)小兒胃管改制），采卵管即達(dá)該側(cè)子宮角頂端（深約30 cm）。隨后用10 mL無(wú)菌注射器吸取加溫至38～39 ℃的1×PBS（磷酸鹽緩沖液）6～8 mL，自采卵管注入子宮角，立即回收沖胚液?；厥諘r(shí)微微前后轉(zhuǎn)動(dòng)采卵管，以防孔道被子宮黏膜堵塞。如此反復(fù)沖洗3次[16]。

1.5 胚胎的檢查和評(píng)定

沖胚液回收之后，盡快在20 min內(nèi)置于體視鏡下檢查收集到的胚胎，并用檢胚細(xì)管將胚胎移至新鮮培養(yǎng)液滴中，移胚時(shí)注意動(dòng)作緩慢，防止胚胎跑飛。通過(guò)體視鏡來(lái)對(duì)胚胎形態(tài)進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)鑒定，即將體視鏡調(diào)至80～100倍，觀(guān)察胚胎形態(tài)、卵裂球的大小與均勻度、透明帶的間隙、變性等情況，只有形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常的胚胎才能進(jìn)行移植[17]。一個(gè)理想的胚胎，其發(fā)育階段應(yīng)與回收時(shí)達(dá)到的胚齡保持一致，胚胎大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊，透明帶均勻一致，胚內(nèi)細(xì)胞間的界限清晰可見(jiàn)，沒(méi)有不規(guī)則分布的空泡，無(wú)細(xì)胞碎片。

1.6 胚胎的移植

胚胎的移植是胚胎移植技術(shù)的最后一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。胚胎的移植技術(shù)決定移入受體的早期胚胎能否順利發(fā)揮其遺傳潛能而發(fā)育成一個(gè)完整后代。與采胚方法相同，羊胚胎移植也分為手術(shù)法和非手術(shù)法2種。移植時(shí)注意觀(guān)察受體羊兩側(cè)卵巢的紅體（排卵點(diǎn)）的分布情況，卵巢上無(wú)紅體或紅體發(fā)育不健全的受體羊不作為羊胚胎移植受體。

1.6.1 手術(shù)法。常使用含5%胎牛血清的D杜氏磷酸緩沖液移植[18]。同期發(fā)情處理后的受體母羊限水、禁食24 h進(jìn)行，手術(shù)前對(duì)手術(shù)部位剪毛、剃毛、消毒。肌肉注射2%靜松靈0.5～0.8 mL進(jìn)行麻醉，手術(shù)器械等用0.1%新潔爾滅液浸泡30 min常規(guī)消毒，烘干待用。移植方法同胚胎采集方法。為了使胚胎發(fā)育階段與其應(yīng)所處的生理狀態(tài)一致，應(yīng)將16-細(xì)胞之前的細(xì)胞移入輸卵管，而桑葚胚以后的胚胎移入子宮角前1/3，提高胚胎成功附植到受體子宮而發(fā)育成完整個(gè)體的可能性[19]。

1.6.2 非手術(shù)法。在受體發(fā)情后6～12 d，通過(guò)人醫(yī)用的子宮探針或膽囊探針作導(dǎo)管的引子，使探針前端稍彎曲，導(dǎo)管便能順著子宮頸螺旋形管道前進(jìn)，把胚胎注入子宮頸內(nèi)[16]。此法操作技術(shù)繁瑣復(fù)雜，需反復(fù)實(shí)踐練習(xí)。

2 羊胚胎移植的應(yīng)用現(xiàn)狀

胚胎移植技術(shù)是繼人工授精之后最具有應(yīng)用價(jià)值的生育繁殖技術(shù)，能夠大大提高繁殖效率，充分發(fā)揮良種母羊的繁殖能力，保證優(yōu)良品種的大量擴(kuò)繁。近年來(lái)，我國(guó)普遍從國(guó)外進(jìn)口優(yōu)質(zhì)胚胎來(lái)解決我國(guó)優(yōu)質(zhì)種羊品種短缺問(wèn)題，各級(jí)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣部門(mén)及畜禽生產(chǎn)公司從澳大利亞、新西蘭、德國(guó)等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家引進(jìn)大量?jī)?yōu)質(zhì)羊胚胎，用于擴(kuò)繁優(yōu)良品種種群體系，收效顯著。我國(guó)國(guó)家科技攻關(guān)項(xiàng)目“肉羊舍飼、半舍飼養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)化示范”將羊的胚胎移植作為關(guān)鍵技術(shù)之一，進(jìn)行了產(chǎn)業(yè)化試驗(yàn)與示范；同時(shí)，“十五”期間，在內(nèi)蒙古等地還實(shí)施了綿羊的“萬(wàn)枚胚胎工程”項(xiàng)目。這些項(xiàng)目的實(shí)施和完成，為我國(guó)肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展作出了突出性貢獻(xiàn)。但是，目前我國(guó)羊胚胎移植應(yīng)用現(xiàn)狀與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，還不夠成熟，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

（1）胚胎移植是一項(xiàng)比較復(fù)雜的生物繁育技術(shù)，要求項(xiàng)目管理人員及操作人員具備相當(dāng)高的理論知識(shí)水平以及豐富的實(shí)踐操作經(jīng)驗(yàn)。目前，我國(guó)掌握高水平羊胚胎移植技術(shù)的專(zhuān)業(yè)人員非常匱乏，除了高校、科研院所及專(zhuān)業(yè)移植公司有少量專(zhuān)業(yè)人員掌握該項(xiàng)技術(shù)外，基層畜牧推廣單位及人員很少具備此項(xiàng)技能，限制了羊胚胎移植技術(shù)的推廣和應(yīng)用。因此，加強(qiáng)基層專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員的培訓(xùn)力度，讓更多的基層人員掌握胚胎移植技術(shù)，使胚胎移植技術(shù)在優(yōu)秀種羊的引種、擴(kuò)繁、品種改良與育種等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。

（2）羊在胚胎移植后，營(yíng)養(yǎng)水平不精細(xì)、飼養(yǎng)條件粗放、環(huán)境衛(wèi)生不達(dá)標(biāo)，是導(dǎo)致成功率低的主要因素。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)飼養(yǎng)人員的技術(shù)指導(dǎo)，培養(yǎng)飼養(yǎng)員科學(xué)的飼養(yǎng)管理意識(shí)，保證羊胚胎移植后飼養(yǎng)環(huán)境清潔、舒適，并設(shè)計(jì)科學(xué)的飼養(yǎng)配方，給予充足的營(yíng)養(yǎng)，提高胚胎發(fā)育成完整個(gè)體的潛力，從而提高移植率和產(chǎn)羔率。

（3）胚胎移植花費(fèi)較高，整個(gè)流程耗費(fèi)大量的人力物力財(cái)力，主要包括購(gòu)買(mǎi)試劑耗材、大型實(shí)驗(yàn)儀器、供體羊受體羊的購(gòu)置及相關(guān)人員的培訓(xùn)指導(dǎo)費(fèi)。因此，國(guó)家有關(guān)部門(mén)及地方政府進(jìn)一步加大胚胎移植技術(shù)方面的財(cái)政補(bǔ)貼補(bǔ)助，落實(shí)支持畜牧業(yè)發(fā)展的項(xiàng)目規(guī)劃，將有利于此項(xiàng)技術(shù)的推廣和應(yīng)用，推動(dòng)羊品種改良進(jìn)程[20]。

（4）隨著肉羊產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，胚胎移植技術(shù)在種羊生產(chǎn)上的應(yīng)用不斷推進(jìn)，目前，有不少地方對(duì)胚胎移植市場(chǎng)的監(jiān)管不到位，導(dǎo)致品種惡意炒作、假冒偽劣現(xiàn)象屢有發(fā)生。因此，國(guó)家畜牧獸醫(yī)行政主管部門(mén)應(yīng)肩負(fù)起責(zé)任，加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管，制定相關(guān)規(guī)定，嚴(yán)厲打擊假冒偽劣品種，使羊胚胎移植市場(chǎng)能夠健康、高效、持續(xù)地發(fā)展。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著我國(guó)居民生活水平不斷提高，傳統(tǒng)的肉羊飼養(yǎng)和繁育模式難以滿(mǎn)足人民對(duì)肉羊需求。羊胚胎移植技術(shù)的誕生和廣泛應(yīng)用，改變了傳統(tǒng)的繁殖和生產(chǎn)方式，提高了養(yǎng)羊業(yè)的生產(chǎn)效率，推動(dòng)了現(xiàn)代化畜牧業(yè)的發(fā)展，保障了優(yōu)質(zhì)、足量的羊肉供應(yīng)。羊胚胎移植技術(shù)的規(guī)范應(yīng)用，必將對(duì)我國(guó)肉羊生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

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