膏霜類化妝品中瑞香科植物禁用成分的表面離子化-高分辨質(zhì)譜快速識別技術(shù)研究

(1.威海出入境檢驗檢疫局，威海 264200；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 10026；3.中國檢驗認證集團檢驗有限公司，北京 10026)

2015年2月，中韓雙方完成中韓自貿(mào)協(xié)定全部文本的草簽，至此，我國迄今涉及國別貿(mào)易額最大、領(lǐng)域范圍最全面的自貿(mào)協(xié)定完成全部談判。中韓自貿(mào)區(qū)的建立和推進，加速了韓國化妝品對我國出口的力度。韓國化妝品雖然有著較好的質(zhì)量和口碑，但由于法律法規(guī)的不同，中韓化妝品中有一些不同的禁用物質(zhì)，比如說很多中藥成分在中國是禁用的，但在韓國(其成為“韓藥”)卻是可添加的，比如瑞香科植物芫花、了哥王和狼毒。這些植物的禁用提取物為黃酮類化合物和雙香豆素類衍生物，在化妝品中有防曬、抗氧化、美白和抑菌的作用[1]，但是在國內(nèi)，因其本身的毒性被禁止添加到化妝品中。所以研究中韓化妝品中不同的禁限用物質(zhì)，并建立快速檢測方法，是保護我國消費者安全的必要技術(shù)基礎(chǔ)。近年來，直接實時分析質(zhì)譜(Direct Analysis in Real Time-Mass, DART-MS)超速分析方法是中藥加工相關(guān)產(chǎn)業(yè)的研究熱點之一。其無需溶劑輔助離子化，操作便捷，在特殊藥物打假[2]、植物藥成分分析[3]等方面均有應(yīng)用。

本研究首次建立了DART-MS/MS快速檢測霜狀化妝品中植物提取物中禁用物質(zhì)的方法，為進口產(chǎn)品快速通關(guān)起到了積極的作用。

1 儀器與試劑

DART SVP離子源(美國)； QExacfive高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)；乙醇為分析純(國藥集團)；甲醇為色譜純(美國thermo Fisher 公司)；芫花和了哥王購自河北安國，以《植物志》相關(guān)植株信息為依據(jù)，由尚孟軍鑒定為芫花和了哥王，原植物為Daphne genkwa Sieb. et Zucc. 和Wikstroemia indica (Linn.) C. A. Mey

2 方法與結(jié)果

2.1 DART與質(zhì)譜儀參數(shù)

DART離子源、傳送管間距25mm，樣品居中；離子源下傾角30°；電暈針電壓4000V；氦氣流速4L/min；氣流溫度350℃；出口電極偏轉(zhuǎn)電壓100V。串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀正離子模式；毛細管電壓4000V；錐孔電壓100V；碰撞能量33V。

2.2 植物提取物的制備

粉碎樣品并將粉碎后樣品過200目篩備用。稱取過篩后樣品5.0g于50mL離心管中，加入30mL70%乙醇振蕩混勻，超聲30min后，經(jīng)6000rap離心10min，取上清液經(jīng)0.2μm濾膜過濾后上機。

2.3 實測樣品的制備

將植物粉碎后進行浸提，吸取20ml提取液于50mL離心管中，氮吹至近干，分別得芫花提取液浸膏13.0mg和了哥王提取液浸膏15.0mg備用。稱取膏霜狀化妝品5.0g，分別加入芫花提取物浸膏或了哥王提取物浸膏，分別混勻，備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 DART與質(zhì)譜儀參數(shù)的優(yōu)化

DART 檢測為樣品表面的待測物經(jīng)離子源解吸并離子化后，在真空泵產(chǎn)生的負壓作用下由傳送接口引入質(zhì)譜儀分析，原理詳見文獻[4]。本實驗的待測物為黃酮類和香豆素類化合物，易結(jié)合質(zhì)子，故設(shè)定為正離子模式。取對照品溶液5μL滴于條形載玻片上，揮干后置滑軌上進行DART 全掃描，質(zhì)譜圖中可見芫花素m/z285.0744[M+H]+、羥基芫花素m/z301.0693[M + H]+、西瑞香素m/z353.0639[M + H]+和芫花素m/z285.0761[M + H]+，比較不同條件下信號的強弱，選擇信號強且穩(wěn)定時的參數(shù)。試驗發(fā)現(xiàn)，氦氣( He) 的靈敏度明顯高于氮氣( N2)，故選擇He；He流速固定為4 L·min- 1; 比較氣流溫度時發(fā)現(xiàn)待測物在100℃和200 ℃時幾乎沒有信號， 300 ℃時信號較高，至350 ℃時信號達到最高，升到400 ℃又有下降，故選350 ℃; 離子源與傳送管距離為25 mm，兼顧信號強度和滑軌的運行。

3.2 植物提取物禁用成分DART-MS( FULL SCAN) 分析

按照2.2項的條件采集植物提取溶液的特征譜圖，見圖1和圖2。

圖1 芫花提取物的DART-MS質(zhì)譜圖

圖2 了哥王提取物的DART-MS質(zhì)譜圖

DART屬于復(fù)合型電離, 在正離子工作模式下首先由激發(fā)態(tài)氦氣與空氣中的水分子發(fā)生潘寧電離產(chǎn)生水合物離子與電子, 質(zhì)子化的水分子離子再與目標化合物進行質(zhì)子交換, 可以形成[ M +H]+分子離子峰。本實驗質(zhì)譜條件為正離子檢測，一級質(zhì)譜掃描為全掃描，質(zhì)量數(shù)范圍為100～1000m/z。一級質(zhì)譜全掃描等相關(guān)條件見表1。

表1 植物提取物中特征性目標化合物中、英文名稱，分子式，分子量

故芫花提取物中的芫花素和羥基芫花素，其m/z分別為285.0744和301.0693；了哥王植物提取物中的西瑞香素和芫花素，其m/z分別為353.0639和285.0761。其相對應(yīng)的分子離子峰結(jié)果可見圖3～圖6。由此可見，DART-MS 特征圖譜具有明顯的指紋性特征，借助DART能夠進行快速、直觀地鑒別相關(guān)的植物。

圖3 芫花提取物中芫花素的一級質(zhì)譜圖

圖4 芫花提取物中羥基芫花素的一級質(zhì)譜圖

圖5 了哥王提取物中西瑞香素的一級質(zhì)譜

圖6 了哥王提取物中芫花素的一級質(zhì)譜

3.3 植物提取物禁用成分質(zhì)譜峰的確認

由于一級質(zhì)譜可能存在假陽性，需進行二級質(zhì)譜確證。本實驗質(zhì)譜條件為正離子檢測，掃描范圍100～850m/z，二級質(zhì)譜全掃描等相關(guān)條件見表2。

表2 目標化合物二級質(zhì)譜測定參數(shù)

芫花素和了哥王植物提取物中目標化合物的CID質(zhì)譜圖和裂解示意，見圖7～圖10。其中，芫花素在正離子測定模式下準分子離子峰m/z285.21進行二級質(zhì)譜分析，該離子丟失一個甲基生成m/z270.0526離子，碎片m/z242.0576 ；羥基芫花素在正離子模式下準分子離子峰m/z301.07進行二級質(zhì)譜分析，該離子丟失一個甲基生成m/z286.0475離子，碎片m/z258.0528為m/z286.0475峰脫去一個-(CH2)2形成的；西瑞香素在正離子測定模式下準分子離子峰m/z353.07，該離子脫去一個甲基形成m/z338.0425，再通過聯(lián)苯醚的碳氧鍵斷裂，形成m/z179.0342的離子。

圖7 芫花提取物中芫花素m/z285.1二級質(zhì)譜圖

圖8 芫花提取物中羥基芫花素m/z301.1二級質(zhì)譜圖

圖9 了哥王提取物中西瑞香素m/z353.1二級質(zhì)譜圖

圖10 了哥王提取物中芫花素m/z285.1二級質(zhì)譜圖

3.4 實測樣品中植物提取物禁用成分DART-MS( SCAN) 分析

按照2.3的條件分別制作芫花和了哥王植物提取物實測樣品，混勻后直接按照3.2的掃描條件進行DART-MS(SCAN)分析。結(jié)果如圖11～圖16所示。

圖11 膏霜狀化妝品中芫花植物禁用成分DART-MS(FULL SCAN)質(zhì)譜圖

圖12 膏霜狀化妝品中了哥王植物禁用成分DART-MS(FULL SCAN)質(zhì)譜圖

圖13 實測樣品中芫花所含芫花素的一級質(zhì)譜圖

圖14 實測樣品中芫花所含羥基芫花素的一級質(zhì)譜圖

圖15 實測樣品中了哥王所含西瑞香素的一級質(zhì)譜圖

圖16 實測樣品中了哥王所含芫花素的一級質(zhì)譜圖

從圖11～圖16可見，DART-MS在正離子模式下對實測樣品進行了全掃描，結(jié)果顯示，可以從膏霜狀化妝品中分別檢測出芫花中的芫花素、羥基芫花素，以及了哥王中的芫花素和西瑞香素。

4 結(jié)論

采用DART-MS建立的檢測方法無需前處理和色譜分離，無需制備流動相，減少了試劑的耗費，交叉污染很小，單個樣品分析( 測定3次) 約20 s，檢測速度快。SCAN 模式的DART-MS 特征圖譜包含豐富的定性信息，能對植物源性化妝品等復(fù)雜基質(zhì)進行鑒別，可以找出化妝品中相關(guān)的植物禁用物，同時該圖譜具有較好的重復(fù)性，可借助化學計量學方法對數(shù)據(jù)進一步處理。能夠很好的解決韓國進口化妝品中國內(nèi)禁用植物成分的快速篩查，提高通關(guān)速度。該法為定性方法，在定量的準確度方面較常規(guī)色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法尚有不足，因其具有原位、直接、快速檢測的優(yōu)勢并兼有強大的定性能力，在快速真?zhèn)味ㄐ澡b別、高通量篩查或快速定量分析時具有優(yōu)勢和應(yīng)用前景。