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    市售酸奶中乳酸菌的抗氧化和耐酸耐膽鹽能力分析

    2018-10-12 12:07:18姚沛琳徐禮生張興桃高貴珍
    宿州學院學報 2018年7期
    關(guān)鍵詞:膽鹽活菌酸奶

    姚沛琳,蘇 博,徐禮生,張興桃,高貴珍

    宿州學院生物與食品工程學院,宿州,234000

    乳酸菌不僅具有抗癌抗衰老、降低膽固醇、增強機體免疫力、緩解乳糖不耐癥等功效,還能賦予發(fā)酵制品特殊的風味[1],因此常用于發(fā)酵食品中?;罹退崮滔鄬τ诔厮崮?,不同點在于產(chǎn)品中有活菌的存在,而活菌的數(shù)量和菌株的性能是該類產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵[2]。根據(jù)我國相應(yīng)的國家標準[3],活菌型酸奶中的活菌必須達到一定數(shù)量才能在人體發(fā)揮功效,我國國家標準規(guī)定酸奶中活菌的含量應(yīng)達到1×106cfu/mL。活性乳酸菌必須順利通過復雜的人體消化系統(tǒng)和極端的胃腸道環(huán)境,才能在人體真正發(fā)揮益生作用[4]。

    近年來,一些活菌型酸奶因獨特的口感和所宣傳的益生功效為人們所喜愛。研究表明,酸奶中使用的菌株多數(shù)具有較好的耐酸耐膽鹽性能和抗氧化能力[5-7]。在購買行為上,消費者更易受廣告宣傳的誘導。但并不是所有酸奶都具有所宣傳的效果,酸奶中添加的菌株是否能夠在人體發(fā)揮有益作用,有待進一步研究[8]。

    為了探討活菌型酸奶中所含菌株能否在人體消化系統(tǒng)中存活以及是否具有抗氧化能力,本文以市售6種常見品牌旗下9款活菌性酸奶為研究對象,從中分離純化得到乳酸菌菌株,通過消除自由基等實驗分析菌株的抗氧化能力,通過耐酸耐膽鹽性實驗測定菌株對酸和膽鹽的耐受性。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    實驗材料與試劑:酸奶選自宿州市大潤發(fā)超市中售賣的6個品牌旗下9款酸奶(4 ℃下保存):衛(wèi)崗風味酸奶、蒙牛優(yōu)益C、養(yǎng)樂多、君樂寶純享、伊利pureDay、蒙牛冠益乳、君樂寶每日活菌、伊利life up、光明暢優(yōu);MRS肉湯培養(yǎng)基;二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、丙三醇、豬膽鹽、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸等,均為分析純,購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

    儀器:LDZX-50KBS高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);WT-2ND超凈工作臺(北京玉堂藍翼科技有限公司);SHP-400電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司);721G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司);H1850臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 乳酸菌的分離純化

    根據(jù)文獻[9-11]中方法,將9款酸奶樣品分別進行10×梯度稀釋,選擇適宜的稀釋度,涂布于MRS固體平板上,培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。從平板上挑取單個形態(tài)不同的可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色并鏡檢,選擇G+菌且無芽孢的菌株在MRS瓊脂平板上多次劃線。挑取純化后的單菌落,將其接入MRS肉湯培養(yǎng)基內(nèi)進行增菌,收集對數(shù)期的菌體,以甘油為保護劑,置于-40 ℃冷凍室內(nèi)進行菌種保藏。

    1.2.2 菌株的抗氧化能力實驗

    從保菌管中取出1 mL菌液置于MRS肉湯培養(yǎng)基中,連續(xù)活化3代,將活化好的菌液在8 000 r/min下離心15 min,收集上清液即為實驗所需發(fā)酵液。

    1.2.2.1測定菌株的DPPH·自由基清除能力

    結(jié)合文獻中方法[12-14],并加以改進。取樣品2.0 mL,加入95%乙醇2.0 mL,混勻后再加入2.0 mL濃度為0.2 mmol/LDPPH溶液于試管中搖勻,避光放置60 min后,于3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,用95%乙醇作參比,測定其吸光度A1。同時把2 mL的0.2 mmol/L DPPH溶液與2 mL的95%乙醇混合,以PBS緩沖液代替樣品,測其吸光度A2。把1 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基與2 mL的95%乙醇混合,再加入DPPH溶液,反應(yīng)后在517 nm處測吸光度A3。

    DPPH·自由基清除率用下式表示:

    清除率=(A3-A1)/A2×100%

    1.2.2.2 測定菌株的羥自由基(HO·)清除能力

    結(jié)合文獻中方法[15],并加以改進。將2 mL的6 mmol/L硫酸亞鐵溶液與2 mL的6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合后,加入2 mL的20 mmol/L的過氧化氫溶液進行反應(yīng),再加入2 mL樣品,37 ℃恒溫水浴1 h,于3 000 r/min下離心10 min。冷卻15 min后取上清液,在510 nm處測定吸光值A(chǔ)1。用雙蒸水取代樣品,測定吸光值A(chǔ)2,用MRS肉湯培養(yǎng)基取代樣品,測定吸光度A3。

    HO·清除率用下式表示:

    清除率=(A3-A1)/A2×100%

    1.2.2.3 測定菌株的還原性

    根據(jù)文獻中方法[16],將1 mL樣品與1 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH7)混合,再加入1 mL的1%的鐵氰化鉀溶液?;靹蚝笥?0 ℃下水浴20 min,冷卻后加入2.0 mL的10%的三氯乙酸,4 000 r/min離心10 min,取2 mL上清液,和2 mL的0.1%三氯化鐵溶液反應(yīng)后,在700 nm處測吸光度。吸光度越高,說明反應(yīng)混合物所對應(yīng)的菌體的還原性越強,樣品的總抗氧化能力越高。

    1.2.2.4 菌株耐酸性實驗

    根據(jù)文獻中方法[17],將活化好的菌株以2%的量分別接種于pH值為2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h,測定各組菌液的OD600值。

    1.2.2.5 菌株的耐膽鹽實驗

    根據(jù)文獻中方法[18],將活化好的菌株以2%的量分別接種于豬膽鹽濃度為0,0.3,0.5,0.7 g/L的MRS肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h,測定各組菌液的OD600值。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 乳酸菌分離結(jié)果

    使用加有指示劑溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基,挑選能使培養(yǎng)基顏色變黃的乳白色或乳黃色,邊緣齊整,表面凸起或扁平的典型單菌落[19],同時過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性菌,初步確定從9款酸奶中分離出17種乳桿菌,其菌落形態(tài)及細胞特征如表1所示。

    表1 乳酸菌菌落形態(tài)及細胞特征

    2.2 菌株的抗氧化實驗結(jié)果

    2.2.1 菌株的DPPH·自由基清除能力

    DPPH·自由基是一種常見的穩(wěn)定的有機自由基,對人體器官具有極強的損害作用,常用于體外抗氧化實驗的研究。其乙醇溶液呈深紫色,在517 nm處有強吸光性,當自由基清除劑加入DPPH溶液時,肉眼可見紫色變淺或消退,在517 nm處吸光性減弱[20]。本實驗通過這一特性檢測菌株的抗氧化能力,結(jié)果如圖1所示。

    圖1 不同菌株對DPPH·自由基的清除能力

    由圖1可知,17株菌株對DPPH·自由基具有不同程度的清除能力,清除率均在25%以上。各菌株清除率相差較大,清除率最高的是分離自伊利PureDay 酸奶中的15號菌株,清除率高達39.86%。清除率最低的是分離自養(yǎng)樂多的4號菌株,清除率僅有28.02%。

    2.2.2 菌株的HO·自由基清除能力

    羥自由基具有很強的氧化性,對生物細胞大分子有較大的損害作用[21]。本實驗通過這一特性檢測菌株的抗氧化能力,結(jié)果如圖2所示。17株菌株對羥基自由基具有不同程度的清除率,清除率在37%~48%之間。各組菌株清除率相差不大,清除率最高的是分離自養(yǎng)樂多的4號菌株,清除率高達47.83%。清除能力最低的是分離自光明暢優(yōu)的14號菌株,清除率僅有37.68%。

    圖2 不同菌株對HO·自由基的清除能力

    2.2.3 菌株的還原能力

    菌株的還原能力與其所含有的抗氧化劑息息相關(guān),還原能力越強,清除自由基效率越高,抗氧化性就越強[21]。本實驗利用這一特性測定不同菌株的還原能力,所測的值為樣品稀釋2倍后的結(jié)果,如圖3所示。

    由圖3可知,除1號與2號菌株還原能力相對較弱以外, 其他15種菌株的還原能力均較強,總抗氧化能力較強。

    圖3 不同菌株的還原能力

    2.2.4 菌株的耐酸性實驗結(jié)果

    人體胃液的pH值約為2~3,在體外有較好益生作用的乳酸菌必須能順利通過胃液極端的酸性環(huán)境,才能在體內(nèi)發(fā)揮益生作用[4,22]。為了探討從酸奶中分離出的菌株的耐酸性,設(shè)立了pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7 6個不同的生長環(huán)境,37 ℃培養(yǎng)16 h后測定其吸光值,吸光值越高,證明菌株的耐酸性越強。結(jié)果如圖4所示。

    圖4 耐酸實驗結(jié)果

    由圖4可知,除4、7、10號菌株對酸性極為不耐受外,各菌株的最適pH值均為6。隨著pH值的降低,各菌株均減緩甚至停止生長。由此可得知,菌株在人體胃液環(huán)境下幾乎沒有活性。

    2.2.5 菌株的耐膽鹽實驗結(jié)果

    乳酸菌除了需要經(jīng)受人體極端的酸性環(huán)境的考驗,還需要經(jīng)受人體消化道的高膽鹽環(huán)境的考驗。為了探討從酸奶中分離出的菌株的耐膽鹽能力,設(shè)立了4個不同的膽鹽濃度,分別為0 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L和0.7 g/L,37 ℃培養(yǎng)16 h后測定其吸光值,吸光值越高,證明菌株的耐膽鹽能力越強。結(jié)果如圖5所示。

    由圖5可知,在無膽鹽環(huán)境下各項菌株活性最大,隨著膽鹽濃度的增加,菌株活性逐漸減弱,在0.5 g/L和0.7 g/L膽鹽濃度下幾乎不生長。人體膽鹽濃度一般為0.3 g/L,除了4、7、10號菌株對膽鹽耐受能力較低外,其他各菌株對膽鹽的耐受性較好。

    圖5 耐膽鹽實驗結(jié)果

    3 結(jié) 語

    酸奶屬于乳酸菌發(fā)酵型制品,乳酸菌菌株及其代謝產(chǎn)物可以促進腸道蠕動,改善人體消化功能,但乳酸菌能夠充分發(fā)揮益生作用的前提是可以大量、有活性地通過人體腸道[22-23]。由上述實驗結(jié)果可知,從市售酸奶中分離出的乳酸菌菌株,對酸性環(huán)境不耐受,即使是耐酸性較強的嗜酸乳桿菌,在pH2~3的條件下也幾乎不存在活性,在人體腸胃的酸性條件下不能很好地發(fā)揮作用。在耐膽鹽實驗中,絕大多數(shù)菌株表現(xiàn)出較好的耐膽鹽能力,對人體胃腸道中的膽鹽具有耐受性。

    由抗氧化結(jié)果可知,菌株的DPPH·自由基清除能力、HO·自由基的清除能力和還原能力有較大差異,其中前兩項差別較大。同一株乳酸菌在三種不同的抗氧化實驗中進行測定,所得出的結(jié)果也不相同??赡苁且驗椴煌樗峋锌寡趸饔玫幕钚晕镔|(zhì)不同,同種乳酸菌對不同物質(zhì)的清除的機制不同。但總體來說,各菌株抗氧化能力均較強。

    綜上所述,市售酸奶所選用的菌種總體性能良好,抗氧化能力與耐膽鹽性較強,但對酸性環(huán)境的耐受性不強,還需要進一步開發(fā)對酸性環(huán)境有較好耐受性的優(yōu)良菌株。

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