2種國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)與電化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測CA72-4的一致性評價

魏衍財，鄭維玲，石 燕，宋妙麗，葉科學(xué)，盧 旬，楊 辰

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，江蘇 蘇州 215002）

糖類抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA72-4）作為一種較新的腫瘤標(biāo)志物，對胃癌、卵巢黏液性囊腺癌和非小細(xì)胞肺癌具有相對較高的敏感性和特異性，可對這3類癌癥進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，以指導(dǎo)治療和預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)。目前，在實際工作中，由于不同檢測系統(tǒng)之間影響因素較多，導(dǎo)致CA72-4的檢測結(jié)果存在差異。2006年，衛(wèi)生部辦公廳印發(fā)《衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)間檢驗、醫(yī)學(xué)影像檢查互認(rèn)有關(guān)問題的通知》要求實現(xiàn)檢驗結(jié)果的互認(rèn)[1]。因此，評估不同檢測系統(tǒng)之間的差異，為實驗室間檢測結(jié)果的互認(rèn)提供基礎(chǔ)。美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2013年8月發(fā)布了EP09-A3文件[2]，為生產(chǎn)廠家和臨床實驗室提供了最新的方法學(xué)比對和偏移評估方法。本研究參照EP09-A3文件，以電化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)為參比方法，以2種國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)為實驗方法，對3種檢測系統(tǒng)測定CA72-4的一致性進(jìn)行了評價，為實驗室和臨床工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院本部住院及門診患者表觀正常（無溶血、黃疸和脂血等）的新鮮血清樣本，分裝后于-80 ℃保存。共收集42份樣本，其中CA72-4濃度分布為0～6.9 U/ mL（6.9 U/mL為CA72-4生物參考區(qū)間上限）的樣本8份，6.9～50.0 U/mL的樣本24份，50.0～300.0 U/mL的樣本10份，比對數(shù)量符合CLSI EP09-A3文件要求（至少40份樣本）。

1.2 試劑與儀器

cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士Roche公司），MAGLUMI 4000全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（深圳新產(chǎn)業(yè)公司），CL-2000i化學(xué)發(fā)光分析儀（深圳邁瑞公司），試劑、校準(zhǔn)品均為各儀器配套試劑。腫瘤標(biāo)志物質(zhì)控品（批號54601、54602）購自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 比對系統(tǒng) 以cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）組成的檢測系統(tǒng)（簡稱e601檢測系統(tǒng)）作為參比系統(tǒng)（X），以MAGLUMI 4000全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑（化學(xué)發(fā)光法）組成的檢測系統(tǒng)（簡稱MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)）作為待評系統(tǒng)1（Y1），以CL-2000i化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑（化學(xué)發(fā)光法）組成的檢測系統(tǒng)（CL-2000i檢測系統(tǒng)）為待評系統(tǒng)2（Y2）。

1.3.2 樣本檢測 測定之前校準(zhǔn)儀器，并且室內(nèi)質(zhì)控在控。按照EP09-A3文件要求，同時使用3種檢測系統(tǒng)隨機(jī)單次測定42份血清樣本，記錄CA72-4檢測結(jié)果。

1.3.3 離群值檢查 根據(jù)EP09-A3文件要求，使用廣義極端學(xué)生化偏差（extreme studentized deviate，ESD）法檢驗離群值。具體步驟：（1）根據(jù)42份樣本的測定結(jié)果計算[（Y-X）/X]的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），并根據(jù)和s計算最大偏移（ESDi）；（2）根據(jù)檢驗統(tǒng)計的樣本數(shù)量計算臨界值（λi）；（3）若ESD1＞λ1，則認(rèn)為該觀察值為離群值，剔除后需進(jìn)行第2個最大偏移的計算和比較；（4）離群值的個數(shù)通過找到最大的i，使ESDi＞λi來確定；（5）剔除離群值后，樣本數(shù)量至少40份，如不足，需補(bǔ)充。

1.3.4 方法比對 繪制偏差圖、散點圖、柱狀圖。根據(jù)不同分析方法間濃度差值偏差圖、百分比差值偏差圖、濃度差值排序偏差圖和百分比差值排序偏差圖所呈現(xiàn)的潛在特征，選擇最合適的回歸模型（OLR、WLS、Deming、Passing-Bablok）對不同比對系統(tǒng)的結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析。

1.3.5 偏移估計 先進(jìn)行偏移初步估計。繪制不同比對系統(tǒng)間差值頻數(shù)柱狀圖，并分析柱狀圖特征。如為正態(tài)分布，則使用參數(shù)檢驗（均值）估算偏移；如為非正態(tài)分布，則使用非參數(shù)檢驗（中位數(shù)）估算偏移。根據(jù)以上得到的回歸方程計算醫(yī)學(xué)決定水平處的偏移，以≤1/2偏移（±7.65%）（數(shù)據(jù)來源于2016年上海市臨床檢驗中心室間質(zhì)評的平均偏移）為可接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2010、SPSS 16.0和MedCalc 9.2.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。選取最合適的回歸模型計算不同比對系統(tǒng)的偏移，正態(tài)分布檢驗采用K-S檢驗，顯著性檢驗采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 離群值檢驗

2.1.1 目測法檢驗離群值 采用3種檢測系統(tǒng)測定CA72-4，繪制散點圖。結(jié)果顯示e601檢測系統(tǒng)（X）與MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)（Y1）的相關(guān)性良好[Y1=5.020 6+1.149 8X（r2=0.786 7）]，e601檢測系統(tǒng)（X）與CL-2000i檢測系統(tǒng)（Y2）的相關(guān)性良好[Y2=0.726 3+0.830 0X（r2=0.867 7）]。目測2個不同比對系統(tǒng)之間各有1個異常值。見圖1、圖2。

2.1.2 使用廣義ESD法檢驗 根據(jù)CLSI EP09-A3文件中描述的廣義ESD法進(jìn)行離群值檢驗，結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)離群值。見表1。

2.2 方法學(xué)比對與偏移評估

2.2.1 不同比對系統(tǒng)方法間差值潛在特征分析及最佳回歸模型選擇 參照EP09-A3文件，繪制3種檢測系統(tǒng)CA72-4檢測結(jié)果濃度差值偏差圖、百分比差值偏差圖、濃度差值排序偏差圖和百分比差值排序偏差圖。e601檢測系統(tǒng)與MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)比較，CA72-4檢測結(jié)果除低濃度波動較大外，總體變化恒定，故選擇Deming回歸模型進(jìn)行擬合，見圖3。e601檢測系統(tǒng)與CL-2000i檢測系統(tǒng)比較，差值呈現(xiàn)混合變化，故選擇Passing-Baklok回歸模型進(jìn)行擬合，見圖4。

圖1 e601檢測系統(tǒng)與MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)測定CA72-4的散點圖

圖2 e601檢測系統(tǒng)與CL-2000i檢測系統(tǒng)測定CA72-4的散點圖

表1 不同比對系統(tǒng)間離群值計算結(jié)果

2.2.2 偏移初步估計 正態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，e601檢測系統(tǒng)（X）與MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)（Y1）差值呈非正態(tài)分布（P=0.048），圖形為非鐘形曲線[圖5（a）]，因此采用中位數(shù)作為方法間偏移估算。經(jīng)計算，42份樣本百分比差值的中位數(shù)為-31.46%，大于可接受標(biāo)準(zhǔn)。e601檢測系統(tǒng)（X）與CL-2000i檢測系統(tǒng)（Y2）的差值為正態(tài)分布（P=0.548），圖形為近似鐘形曲線[圖5（b）]，因此采用均值進(jìn)行方法間偏移估算。經(jīng)計算，42份標(biāo)本百分比差值的均值為5.94%，小于可接受標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.3 回歸分析 根據(jù)CLSI EP09-A3文件及不同比對系統(tǒng)間CA72-4測定結(jié)果數(shù)值的變化特征，選取最佳回歸模型進(jìn)行擬合，將CA72-4的醫(yī)學(xué)決定水平（6.9 U/mL）代入最佳回歸方程。經(jīng)計算，e601檢測系統(tǒng)（X）與MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)（Y1）的偏移大于可接受標(biāo)準(zhǔn)，e601檢測系統(tǒng)（X）與CL-2000i檢測系統(tǒng)（Y2）的偏移小于可接受標(biāo)準(zhǔn)。見表2。

圖3 e601檢測系統(tǒng)和MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)測定CA72-4的偏差圖

圖4 e601檢測系統(tǒng)和CL-2000i檢測系統(tǒng)測定CA72-4的偏差圖

圖5 e601檢測系統(tǒng)與MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)、CL-2000i檢測系統(tǒng)的百分比差值頻數(shù)柱狀圖

表2 CA72-4醫(yī)學(xué)決定水平在不同比對系統(tǒng)回歸模型中的偏移結(jié)果

3 討論

CA72-4是目前診斷胃癌的最佳腫瘤標(biāo)志物之一，具有較高的特異性，與糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）聯(lián)合檢測可以監(jiān)測44.91%的胃癌。CA72-4水平與胃癌的分期有明顯的相關(guān)性，一般在胃癌的Ⅲ～Ⅳ期增高，對伴有轉(zhuǎn)移的胃癌患者，CA72-4的陽性率更遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)移者[3]。CA72-4特別有助于卵巢癌檢測，其與CA125及人附睪蛋白4 （human epididymis protein 4，HE4）聯(lián)合檢測，可作為診斷原發(fā)性及復(fù)發(fā)性卵巢腫瘤的生物標(biāo)志物[4]。目前，臨床實驗室檢測CA72-4的方法包括放射免疫分析、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法以及電化學(xué)發(fā)光法等，尤以化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用最為廣泛。但由于不同方法間CA72-4檢測結(jié)果差異較大，故有必要研究不同方法間檢測結(jié)果的一致性。

自CLSI EP09-A3文件發(fā)布以來，尚未見其在標(biāo)記免疫領(lǐng)域的應(yīng)用。EP09-A3文件可用于制造商測量程序聲明比對方法的建立、確認(rèn)以及臨床實驗室新引進(jìn)測量程序的方法比對驗證。EP09-A3要求比對樣本應(yīng)使用未經(jīng)處理的患者標(biāo)本，濃度范圍覆蓋測量范圍。如需使用處理過的樣本（如混合樣本），數(shù)量應(yīng)不超過總樣本數(shù)的20%。相比于EP09-A2文件[5]，EP09-A3文件作了很大修改。在比對數(shù)量方面，EP09-A2文件要求檢測至少40份樣本，按照順序雙次測定；EP09-A3文件規(guī)定至少40份樣本，可單次隨機(jī)測定，操作更加方便。在離群值判斷方面，EP09-A2文件要求通過方法內(nèi)和方法間差值與規(guī)定的可接受值進(jìn)行比較，檢查是否存在離群值；EP09-A3文件采用廣義ESD法判斷離群值，從單變量數(shù)據(jù)集中檢測離群值，當(dāng)異常值的數(shù)量未知時，假定絕大多數(shù)數(shù)據(jù)點的分布是正態(tài)分布，經(jīng)過計算及與臨界值的比較，判斷是否為離群值，該方法隨著樣本數(shù)量的增加而變得更加可靠。在選取回歸模型和偏移計算方法方面，EP09-A2文件規(guī)定方法間差值僅使用簡單的線性回歸模型進(jìn)行擬合，使用分布?xì)埐罘ㄓ嬎闫骄?；EP09-A3文件提供了4種回歸模型，首先可利用散點圖和偏差圖進(jìn)行目測分析，并以不同方法間測定結(jié)果的數(shù)據(jù)特征選擇合適的模型進(jìn)行擬合，再根據(jù)回歸方程計算醫(yī)學(xué)決定水平處的偏移，數(shù)據(jù)分析更加科學(xué)。EP09-A3文件的應(yīng)用更加廣泛，方案設(shè)計更加合理，可操作性更強(qiáng)，為臨床實驗室引進(jìn)新的測量程序進(jìn)行方法比對和偏移評估提供了新的依據(jù)。故本研究使用EP09-A3文件提供的比對方法作為指導(dǎo)。

由于e601檢測系統(tǒng)在本實驗室已使用較長時間，參加上海市臨床檢驗中心室間質(zhì)評成績優(yōu)秀，不精密度＜4%，因此將其作為參比方法，以2種國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)（MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)和CL-2000i檢測系統(tǒng)）作為實驗方法。由于不同廠家使用的儀器、試劑中抗體針對的被測物質(zhì)抗原表位、底物不同，且無統(tǒng)一的溯源標(biāo)準(zhǔn)，從而導(dǎo)致了e601檢測系統(tǒng)與MAGLUMI 4000檢測系統(tǒng)測定CA72-4存在較大的差異，這與宋超等[6]的研究結(jié)果（4種進(jìn)口全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測CA19-9的結(jié)果無法完全互認(rèn)）一致。在實際應(yīng)用中，對于不具有可比性的檢測系統(tǒng)，各臨床實驗室可分別建立自己的參考區(qū)間。對于CA72-4項目的允許總誤差，未查閱到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，也沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道，因此本研究將2016年上海市臨床檢驗中心室間質(zhì)評中CA72-4項目平均偏移的1/2作為偏移的可接受標(biāo)準(zhǔn)。

總之，本研究以CLSI EP09-A3文件作為指導(dǎo)，將2種國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)與e601檢測系統(tǒng)的CA72-4測定結(jié)果進(jìn)行比較，評價其一致性，為臨床實驗室選擇檢測方法提供一些參考。