23個(gè)產(chǎn)地瓦松槲皮素、山柰素與醇溶性浸出物含量測(cè)定

李夢(mèng)璐 陳芝華 呂偉旗 湯晟凌

作者單位：1浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（杭州 311400）；2浙江省麗水市人民醫(yī)院藥劑科（麗水 323000）

瓦松是景天科植物瓦松Orostachys fimbriata（Turcz.）Berg.的干燥地上部分，別名瓦花、向天草、天王鐵塔草等，分布于湖北、安徽、浙江、河北、河南、江蘇、甘肅、陜西、青海等省，性酸、苦、涼，歸肝、肺、脾經(jīng)，具有涼血止血，解毒，斂瘡的功效，用于血痢、便血、痔血、瘡口久不愈合等[1-2]?；瘜W(xué)與藥理學(xué)研究表明，瓦松富含黃酮類、苯甲酸類、糖苷類等化合物[3-4]，其中槲皮素與山柰素為主要活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、提高免疫力等作用[5-7]。我國(guó)瓦松分布區(qū)南北跨度大，不同地區(qū)經(jīng)緯度、海拔存在差異，導(dǎo)致瓦松藥材質(zhì)量參差不齊。槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物為2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的瓦松主要藥效成分指標(biāo)。因此，筆者收集我國(guó)9省23個(gè)產(chǎn)地瓦松種質(zhì)資源，采用熱浸法與HPLC法檢測(cè)瓦松中主要藥效成分含有量，并分析經(jīng)緯度、海拔與藥效成分含量間的相關(guān)性，以期為瓦松藥材質(zhì)量控制與良種選育提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1200系列高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Milli-Q Academic超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；YHG-9055A臺(tái)式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器（上海姚氏儀器設(shè)備廠）；FA1204B型電子分析天平（上海平軒科學(xué)儀器有限公司）；JK-WB-2A數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司）；FW135型中藥粉碎機(jī)（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）；RE-2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥 材 槲皮素（批號(hào)B20527）、山柰素（批號(hào)B21132）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。色譜甲醇購(gòu)自北京京科瑞達(dá)科技有限公司；分析級(jí)甲醇、乙醇、鹽酸、乙酸、乙酸銨等均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。2017年9-11月，采集浙江、安徽、陜西、江蘇等9省23個(gè)產(chǎn)地瓦松種質(zhì)資源，由湯晟凌副主任藥師鑒定為景天科植物瓦松Orostachys fimbriata，詳細(xì)種源信息見表1。

表1 瓦松種源信息

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 醇溶性浸出物含量測(cè)定 精密稱取樣品粉末1g，加入 95%乙醇 40mL，室溫靜置 1h，80℃水?。ū３治⒎校┗亓魈崛?0min，趁熱過濾，定容置50mL容量瓶，精密吸取25mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿（重量a）中，80℃水浴蒸干后，于105℃烘箱干燥3.5h，迅速移至干燥器中冷卻，精密稱定重量（b），計(jì)算瓦松樣品中醇溶性浸出物含量為[（b-a）×2]×100%。

2.2 槲皮素與山柰素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Thermo ODS色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇—0.2%乙酸銨（55:45），等度洗脫；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；柱溫 25℃；進(jìn)樣量 25μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取槲皮素與山柰素對(duì)照品，加甲醇配置稀釋成含槲皮素1.96、3.92、7.84、11.76、15.68mg/L，山柰素 5.02、10.04、20.08、30.12、40.16mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.3.1”色譜條件下注入高效液相色譜儀，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗(yàn)槲皮素線性方程為 Y1=77.383X1＋4.183，R2=0.9996，山柰素線性方程為Y2=73.461X2+31.348，R2=0.9998，表明樣品槲皮素與山奈酚分別在1.96～15.68mg/L與5.02～40.16mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 樣品含量測(cè)定 精密稱取樣品粉末1g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇—25%鹽酸溶液（V:V=4:1）混合溶液 50mL，密閉，稱重，80℃水浴回流提取60min，干燥器中冷卻至室溫，甲醇補(bǔ)足差重，搖勻，過濾，取適量濾液，過0.45μm微孔濾膜，按“1.3.1”色譜條件下測(cè)定槲皮素與山柰素峰面積，按“1.3.2”線性方程計(jì)算含量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取槲皮素與山柰素混合對(duì)照品溶液適量，按“1.3.1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，得槲皮素含量RSD值為0.98%，山柰素含量RSD值為0.43%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)取S9樣品6份，按“1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定槲皮素與山柰素含量，得S9樣品平均槲皮素含量為0.241mg/g，RSD值為1.06%，平均山柰素含量為0.663mg/g，RSD值為2.11%，表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 隨機(jī)取S4樣品，按“1.3.3”制備樣品溶液，室溫放置，按“1.3.1”色譜條件，分別于0、2、4、8、12、16、20、24h 進(jìn)樣測(cè)定峰面積，得槲皮素峰面積RSD值為2.53%，山柰素峰面積RSD值為1.58%，表明樣品溶液在室溫條件下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 隨機(jī)取S5樣品0.5g，分別加入槲皮素與山柰素對(duì)照品適量，按“1.3.3”測(cè)定樣品中槲皮素與山柰素含量，計(jì)算加樣回收率（%）=（C－A）/B×100%，A 為該樣品中含有量，B 為加入標(biāo)準(zhǔn)品含量，C為實(shí)際測(cè)得量，各濃度梯度均重復(fù)3次，槲皮素與山柰素平均加樣回收率與RSD值見表2。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用DPS6.55、EXCEL2010、SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，聚類分析采用類平均法。

3 結(jié)果

3.1 瓦松藥效成分含量HPLC優(yōu)化 分別對(duì)槲皮素、山柰素色譜峰在190～400nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行吸收光譜掃描，結(jié)果表明槲皮素與山柰素在272nm與360nm處均有較大吸收峰，通過對(duì)兩波長(zhǎng)下HPLC色譜圖分析，發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)360nm處槲皮素與山柰素色譜峰分離度較良好，同時(shí)參考2015版《中國(guó)藥典》，選擇360nm作為本試驗(yàn)槲皮素與山柰素含量檢測(cè)波長(zhǎng)。在已有文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道基礎(chǔ)上，對(duì)瓦松地上部分槲皮素與山柰素提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了甲醇—25%鹽酸混合溶液體積比3:1、4:1、5:1，提取溫度 70℃、75℃、80℃、85℃，提取時(shí)間 40min、60min、80min對(duì)槲皮素與山柰素提取含量的影響，結(jié)果表明，瓦松槲皮素與山柰素在甲醇—25%鹽酸混合溶液體積比為4:1，80℃條件下回流提取60min即可提取完全。同時(shí)，考察了HPLC流動(dòng)相甲醇—0.2%乙酸銨、甲醇—水、甲醇—0.1%乙酸水流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)在Thermo ODS色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇—0.2%乙酸銨，體積比為55:45，等度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量25μL的色譜條件下，洗脫效果較好，槲皮素、山柰素色譜峰理論塔板數(shù)均大于4000，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

3.2 不同產(chǎn)地瓦松藥效成分含量比較 供試23個(gè)產(chǎn)地瓦松樣品間槲皮素、山柰素與醇溶性浸出物含量差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），平均含量分別為0.215mg/g、0.555mg/g、4.68%。其中，甘肅定西樣品槲皮素含量最高，為0.271mg/g，甘肅榆中山柰素含量最高，為0.769mg/g，河北蔚縣醇溶性浸出物含量最高，為6.56%，見表3。供試瓦松樣品藥效成分均達(dá)到2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的槲皮素與山柰素總量不低于0.2mg/g，醇溶性浸出物不低于3.0%的標(biāo)準(zhǔn)，表明我國(guó)瓦松主要分布區(qū)藥材質(zhì)量較好，遺傳多樣性高，為瓦松優(yōu)良種質(zhì)資源篩選奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖1 瓦松HPLC色譜圖（A:混合對(duì)照品圖；B:樣品圖；1:槲皮素；2：山柰素）

表3 不同產(chǎn)地瓦松藥效成分含量比較

表4 相關(guān)性分析

3.3 相關(guān)性分析 藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育、藥效成分積累受產(chǎn)地環(huán)境因子影響，包括海拔、溫度、濕度、經(jīng)緯度等[10]。相關(guān)性分析顯示，瓦松槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量與緯度、海拔呈正相關(guān)關(guān)系，與經(jīng)度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中槲皮素含量與海拔正相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.7901，與經(jīng)度負(fù)相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.7574，見表4。結(jié)果提示，高緯度、高海拔、低經(jīng)度地區(qū)栽培瓦松有利于槲皮素、山柰素與醇溶性浸出物含量積累。

3.4 聚類分析 以槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量為主要參考指標(biāo)，按照歐氏距離D2=0.87的分類水平，可將23個(gè)產(chǎn)地瓦松樣品劃分為3大類（圖2）。由圖中可知，類群Ⅰ共13個(gè)產(chǎn)地，分別為浙江臨安、浙江富陽(yáng)、浙江景寧、寧夏同心、河南方城、浙江縉云、陜西商洛、安徽銅陵、江蘇盱眙、江蘇句容、河南南召、安徽黃山與陜西銅川，該類群以浙江、江蘇、安徽產(chǎn)地為主，產(chǎn)地海拔較低，槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量較低。類群Ⅱ共3個(gè)產(chǎn)地，分別為浙江瑞安、陜西渭南與寧夏鹽池，該類群瓦松平均藥效成分含量中等。類群Ⅲ共7個(gè)產(chǎn)地，分別為湖北恩施、甘肅定西、河北順平、甘肅榆中、河南許昌、湖北荊門與河北蔚縣，該類群以甘肅、河北、湖北產(chǎn)地為主，大部分采集地位于高海拔地區(qū)，樣品中槲皮素、山柰素、醇溶性成分含量較高。

4 討論

瓦松是我國(guó)傳統(tǒng)民間用藥，具有清熱解毒、涼血、止血、利濕、消腫等功效，已廣泛應(yīng)用于臨床，由于瓦松資源分布廣，藥效成分含有量差異大，導(dǎo)致瓦松市場(chǎng)混亂，影響瓦松藥材產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。本試驗(yàn)收集全國(guó)主分布區(qū)瓦松種質(zhì)資源23份，檢測(cè)其主要藥效成分含有量，同時(shí)分析了生境因子，包括海拔、經(jīng)度、緯度與藥效成分含量間的相關(guān)性，對(duì)瓦松藥材質(zhì)量控制，優(yōu)良種源篩選均具有重要意義。本試驗(yàn)優(yōu)化的瓦松槲皮素、山柰素含量HPLC檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性高，可用于瓦松藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)。

圖2 瓦松聚類分析圖

藥用植物在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的過程中，通過調(diào)節(jié)相關(guān)生防基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控防御性次生代謝產(chǎn)物的積累，抵抗環(huán)境微生物、害蟲、極端溫度、鹽堿、高濕等環(huán)境因子脅迫，其生物學(xué)特性、農(nóng)藝性狀、藥效成分等受遺傳與環(huán)境雙重因素影響，產(chǎn)地、經(jīng)緯度、海拔、氣候條件等環(huán)境因子是影響中藥材生長(zhǎng)與藥效成分含量積累的重要因素[11-12]。本研究表明，我國(guó)主分布區(qū)瓦松藥材質(zhì)量較好，主要藥效成分含量均滿足2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的槲皮素與山柰素總量不低于0.2mg/g，醇溶性浸出物不低于3.0%的標(biāo)準(zhǔn)；23個(gè)產(chǎn)地瓦松槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量均存在顯著差異（P＜0.05），陜西、甘肅、寧夏產(chǎn)瓦松藥效成分含量較高，河南、浙江、安徽產(chǎn)瓦松藥效成分含量相對(duì)較低；瓦松槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量與緯度、海拔呈正相關(guān)關(guān)系，與經(jīng)度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。瓦松在我國(guó)分布地域較廣，本實(shí)驗(yàn)未收集青海、山東、遼寧等地種質(zhì)資源，下一步將重點(diǎn)對(duì)上述地區(qū)開展藥材資源收集與質(zhì)量評(píng)價(jià)工作。從瓦松槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量看，低經(jīng)度、高緯度、高海拔栽培有利于瓦松藥效成分含量積累，篩選瓦松優(yōu)良種質(zhì)資源時(shí)，可優(yōu)先在陜西、甘肅、寧夏等種質(zhì)中選擇。