Vaspin在糖尿病心肌病中的作用及機(jī)制研究

柯 旋，李賓公，郝艷琴，李雪蓮，鄒 晉

(1. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西 南昌 330006；2. 武漢市第三醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430000；3. 江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西 南昌 330006)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是由Rubler等[1]在1972年提出的概念，其典型的結(jié)構(gòu)改變是心肌肥厚及心肌纖維化，早期心臟舒張功能受損明顯，晚期收縮功能受損導(dǎo)致心力衰竭。DCM發(fā)病機(jī)制仍不甚明確，因此有必要深入探究其發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。脂肪因子vaspin被認(rèn)為是心血管保護(hù)因子，可抑制炎癥通路，延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展，但其在DCM中的作用仍不清楚。本研究建立DCM模型，在體內(nèi)探討vaspin是否能改善DCM大鼠心肌纖維化，提高心功能，為治療DCM提供新的方式。

1 材料與方法

1.1實驗動物10周齡♂SD大鼠36只，體質(zhì)量(200±20)g，購于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心，使用許可證號：SYXK(贛)2015-0001。普通飼料購于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心。

1.2試劑鏈脲霉素(streptozocin，STZ)、水合氯醛、Masson染色試劑盒，均購于北京索萊寶生物科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)ELISA試劑盒購于上海研域化學(xué)試劑有限公司; β-actin、GAPDH抗體購于中杉金橋公司；LC3、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax抗體，購于Cell Signaling Technology公司；TGF-β1、Collagen I抗體購于Abcam公司。

1.3動物模型的建立及實驗分組SD大鼠一次性腹腔注射STZ(60 mg·kg-1)，2周后，大鼠尾靜脈采血檢測血糖，血糖高于16.7 mmol·L-1，表示糖尿病模型建模成功。實驗分為以下3組，每組12只大鼠：⑴對照組：正常飼養(yǎng)，腹腔注射生理鹽水(0.5 mL·kg-1·d-1)；⑵DCM組：糖尿病模型成功后，腹腔注射生理鹽水(0.5 mL·kg-1·d-1)，繼續(xù)喂養(yǎng)12周, 糖尿病大鼠出現(xiàn)感染，死亡2只；⑶ Vaspin組：糖尿病模型成功后，腹腔注射vaspin(320 ng·kg-1·d-1)，繼續(xù)喂養(yǎng)12周。

1.4大鼠空腹血糖檢測在實驗前1 d禁食12 h，期間保持正常的飲水，用75%酒精棉球消毒大鼠尾部，用剪刀剪去少許末端，輕輕擠壓，第1滴棄之，第2滴滴于血糖儀上，測得的血糖值即為空腹血糖值。

1.5大鼠心臟彩超測定10%水合氯醛麻醉大鼠，用脫毛膏褪去心前區(qū)毛發(fā)，將大鼠仰臥固定于操作板上，30 MHz頻率探頭在左室乳頭肌水平二維左室短軸切面測量左室舒張末徑(LVIDd)、左室收縮末徑(LVIDs)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、E峰/A峰(Em/Am)，評估大鼠的心功能。

1.6ELISA檢測實驗?zāi)瑥拇笫蟮念i靜脈竇抽血，3 000 r·min-1離心5 min，取上清，按試劑盒說明書檢測TNF-α濃度。

1.7心肌組織病理標(biāo)本制作實驗?zāi)?0%水合氯醛麻醉大鼠后，取出心臟，小心去除臨近大血管，用預(yù)冷PBS 沖洗后，按冠狀水平將左心室平均切成兩部分，一部分-80℃保存，用于蛋白檢測備用，另一部分置于10%中性福爾馬林溶液中室溫下固定。脫水處理后，石蠟包埋切片，切成4 μm薄片，脫蠟后行Masson染色。

1.8Westernblot檢測剪取各組大鼠心臟組織，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度后，取20 μg蛋白量上樣電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，再用HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h。PBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光液曝光，顯影及定影后，用Image J分析軟件，測得蛋白條帶灰度值，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠體質(zhì)量及空腹血糖的變化如Fig 1所示，糖尿病大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，空腹血糖升高(P<0.01)。相比于DCM組，vaspin處理會增加大鼠體質(zhì)量，降低大鼠空腹血糖(P<0.01)，說明vaspin可改善糖尿病大鼠高血糖水平。

2.2各組大鼠血清中TNF-α的變化如Fig 2所示，與對照組相比，DCM大鼠血清中TNF-α水平升高(P<0.01),而vaspin對TNF-α水平無明顯影響(P>0.05)。

2.3Vaspin改善DCM大鼠的心功能如Fig 3所示，與對照組相比，DCM大鼠LVEF、FS、Em/Am降低(P<0.01)，vaspin處理提高了大鼠LVEF、FS、Em/Am(P<0.01)，說明vaspin可改善DCM大鼠舒張及收縮功能。

2.4大鼠心肌組織中LC3、Beclin-1、p62蛋白表達(dá)的變化如Fig 4所示，與對照組相比，DCM大鼠心肌組織中LC3-II/LC3-I、Bcelin-1的表達(dá)降低，p62表達(dá)升高(P<0.01)。Vaspin處理可以提高LC3-II/LC3-I、Bcelin-1表達(dá)，降低p62表達(dá)(P<0.01)，提示vaspin可提高DCM大鼠心肌組織自噬水平。

2.5大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化如Fig 5所示，與對照組相比，DCM大鼠心肌組織

Fig 1 Changes of body weight and fasting blood glucose in each group n=12)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM

中Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低, Bax/Bcl-2比值升高(P<0.01)。Vaspin處理可以減少Bax表達(dá)，增加Bcl-2表達(dá)，降低Bax/Bcl-2比值(P<0.01)，提示vaspin可減少DCM大鼠心肌組織的凋亡。

2.6Vaspin減少心肌組織中膠原蛋白表達(dá)及心肌膠原沉積Fig 6的Masson染色顯示，相比于DCM組，vaspin組心肌膠原沉積減少(P<0.05)； Western blot結(jié)果顯示，與DCM組相比，vaspin組的Ⅰ型

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsDCM

Fig 4 Expression of LC3, Beclin-1 and P62 in each group n=12)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM

Fig 5 Expression of Bax, Bcl-2 in each group n=12)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM

膠原蛋白表達(dá)減少(P<0.01)，而TGF-β1的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，說明vaspin是通過減少I型膠原蛋白沉積，抑制心肌纖維化，并非通過TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)心肌纖維化。

3 討論

在本研究中，我們成功構(gòu)建了DCM大鼠模型，與大多數(shù)研究不同的是，我們采用STZ(60 mg·kg-1)一次性腹腔注射，繼以普通飼料喂養(yǎng)2周后，血糖明顯升高，出現(xiàn)多飲、多食、多尿，并伴體質(zhì)量明顯下降，并在造模后12 周進(jìn)行驗證，證實出現(xiàn)心肌纖維化和心肌肥厚的糖尿病性心肌病狀態(tài)，說明這種方式可以穩(wěn)定地建立DCM模型。由于我們沒有用高脂飼料喂養(yǎng)，本方法具有安全、可靠、可行性強(qiáng)、方便快捷的優(yōu)點，我們的動物模型機(jī)制上是利用STZ破壞大鼠胰島β細(xì)胞，造成胰島素分泌障礙，因此，考慮我們的模型屬于1型糖尿病心肌病模型。

Vaspin是2005年新研究發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，總體上講，其在心血管疾病中是有利的脂肪因子。Vaspin不僅在脂肪組織、胃、胰腺、肝臟、血管外膜周圍脂肪中有表達(dá)，而且在心外膜脂肪組織也有不同程度的表達(dá)，且由于心外膜脂肪組織、血管壁和心肌之間沒有纖維、筋膜層，所以vaspin可直接作用于整個心臟。Vaspin mRNA在肥胖糖尿病人群中高表達(dá)，糖尿病患者血清vaspin濃度明顯高于非糖尿病人[2]，當(dāng)糖尿病患者合并心血管病變時，血清vaspin濃度降低[3-4]，提示vaspin可作為糖尿病進(jìn)展為糖尿病心血管損傷的敏感標(biāo)記物。進(jìn)一步研究提示，

Fig 6 Effect of vaspin on myocardial fibrosis

A: The expression of Collagen I and TGF-β1 in each group; B: Masson staining (×200); C: Myocardial fibrosis collagen volume fraction (CVF) analysis.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM.

vaspin的降低是一種失代償機(jī)制，具體的vaspin降低機(jī)制仍不是很明確，但是體外實驗提高vaspin的水平，可表現(xiàn)出多種保護(hù)作用機(jī)制。Qi等[5]的研究指出，vaspin可抑制低密度脂蛋白，誘導(dǎo)肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激；Sun等[6]的研究結(jié)果表明，vaspin通過PI3K/Akt/eNOS途徑，調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表達(dá)和功能，可能對糖尿病患者有保護(hù)作用，以防止血管并發(fā)癥的發(fā)生。Vaspin還可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，來延緩小鼠動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)，vaspin可減少糖尿病大鼠心肌凋亡，改善心功能。另外，我們研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織中，除了凋亡蛋白增多外，心肌組織中自噬明顯下調(diào)，vaspin的干預(yù)提高了自噬水平，減少了心肌膠原沉積，改善心肌纖維化。

自噬與DCM心肌纖維化密切相關(guān)。Xu等[8]利用STZ誘導(dǎo)1型糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)小鼠心肌組織中自噬水平降低，與我們的實驗結(jié)果一致。他們在OVE26轉(zhuǎn)基因小鼠中，分別沉默Beclin-1單倍體或ATG16基因后，心肌纖維化和細(xì)胞凋亡水平明顯降低，外源性給予Beclin-1后，小鼠心肌纖維化及細(xì)胞凋亡程度加重，說明提高自噬水平，心肌纖維化及細(xì)胞凋亡程度越嚴(yán)重，1型糖尿病心肌病自噬水平降低是應(yīng)激性保護(hù)。相反，Xie等[9]在OVE26小鼠(1型糖尿病)中發(fā)現(xiàn)，AMPK的減少總是伴有自噬活性的降低，通過激活A(yù)MPK通路可增加糖尿病小鼠自噬水平，改善DCM心肌結(jié)構(gòu)改變，他們的研究結(jié)果和我們一致。在本實驗中，vaspin提高了自噬水平，減少了心肌細(xì)胞凋亡和纖維化程度，但是我們沒有探討自噬與心肌纖維化之間的因果關(guān)系，vaspin可能是通過促進(jìn)自噬，改善心肌纖維化及凋亡，也可能存在自噬以外的其他途徑，參與心肌纖維化及凋亡的調(diào)節(jié)，仍需進(jìn)一步研究證實，但是至少說明提高自噬并沒有加重糖尿病心肌損傷，這一點與Xu等[8]的研究結(jié)果相反。之所以存在上述差異，可能與糖尿病動物模型建立的差異有關(guān)。我們建立的1型糖尿病心肌病模型中自噬是降低的，而且心肌纖維化明顯，與目前眾多的研究一致[10]。在目前研究中，1型糖尿病中自噬是被抑制的，然而自噬抑制是應(yīng)激性保護(hù)作用，還是失代償作用，仍存在分歧，如Xu等[8]的研究提示提高自噬不利于心肌正常功能，而我們的研究和Xie等[9]的研究說明提高自噬可以保護(hù)心肌。而在2型糖尿病研究中自噬上調(diào)的居多，在2型糖尿病早期會有自噬下調(diào)，促進(jìn)自噬有心肌保護(hù)作用[11-12]。

Vaspin可通過PI3K/Akt信號通路，改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能[6]，而PI3K/Akt激活可抑制mTOR，促進(jìn)自噬，并且PI3K/Akt信號通路也可參與心肌纖維化的調(diào)控。我們進(jìn)一步推測，vaspin對DCM中自噬的調(diào)節(jié)可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)，我們團(tuán)隊將利用心肌細(xì)胞在機(jī)制層面進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，既然vaspin可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬，而自噬在心肌肥大[13]、氧化應(yīng)激損傷[14]、胰島素抵抗[15]、晚期糖基化產(chǎn)物[16]等多方面均有重要調(diào)節(jié)作用，這些因素與DCM密切相關(guān)，說明vaspin可通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬，參與多種途徑影響DCM的發(fā)生發(fā)展，甚至參與調(diào)控其他心血管疾病。因此，調(diào)控vaspin可能成為心血管疾病重要治療策略。

(致謝：本實驗在江西省高血壓研究所完成，在此感謝張婉老師及曾俊義老師在實驗中給予的幫助與支持。)