黑枸杞花色苷純化工藝的優(yōu)化與評價

顧子楊,崔夢迪,李玉華,季 拓,潘 揚,潘自皓

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院甲乳外科,江蘇 南京 210001)

黑枸杞是近年來新發(fā)掘的野生植物資源，在我國主要分布于西北地區(qū)的寧夏、青海、新疆等地[1]，其營養(yǎng)豐富，兼具較高的食用和藥用價值，開發(fā)潛力巨大[2-5]。黑枸杞富含花色苷類成分[6-7]。同時，黑枸杞產(chǎn)地自然環(huán)境惡劣，如鹽堿干旱、早晚溫差大、日照強、風力大、海拔高、氧氣稀薄等，在多種環(huán)境因素的脅迫下，相比其他來源(藍莓、黑莓、葡萄等)，黑枸杞花色苷的組成、相對含量與分子結(jié)構(gòu)必然存在特殊性，但這類文獻報道仍然很少，有必要繼續(xù)深入研究。建立高效、簡便的黑枸杞花色苷提取純化工藝，是進行上述研究的前提。本文從前期工作制備的黑枸杞花色苷提取物出發(fā)，通過萃取去除提取物中的脂溶性雜質(zhì)，以及大孔吸附樹脂分離工藝去除水溶性雜質(zhì)，優(yōu)化黑枸杞花色苷的純化工藝，并通過高效液相色譜分析和自由基清除率測定，對純化效果進行評價，從而為黑枸杞花色苷抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究與高附加值產(chǎn)品開發(fā)奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1藥物與試劑黑枸杞干果產(chǎn)自青海省德令哈地區(qū)，由鴻草生物科技(蘇州)有限公司惠贈。甲酸、甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯均為分析純，購自南京化學試劑有限公司；氯化鉀、無水乙酸鈉、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS陽離子自由基)、三氯化鐵和2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，購自上海Aladdin公司(分析純)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基)、沒食子酸，購自SIGMA-ALDRICH公司(分析純)；磷酸(色譜純)，購自天津科密歐化學試劑有限公司；乙腈(色譜純)，購自TEDIA公司；Amberlite XAD-7HP型大孔吸附樹脂，購自SIGMA-ALDRICH公司。

1.2儀器MDF-U5386S型超低溫冰箱(SANYO公司)；LGJ-10型真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；AB204-S型分析天平(Mettler Toledo公司)；5810R型高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；Thermo Mixer C型恒溫混勻儀(Thermo公司)；UV2401PC型紫外可見光分光光度計(SHIMADZU公司)；1260 Infinity型高效液相色譜儀(Agilent公司)。

2 方法

2.1樣品預處理按照文獻[8]所述方法，選取除莖葉的黑枸杞干果，冷凍干燥12 h；粉碎，過篩(150 μm)，-20℃密封避光保藏；使用時取出，真空干燥1 h，得黑枸杞干果粉末。使用1%甲酸，70℃水浴避光靜置提取得提取液。

2.2萃取除雜工藝取適量提取液注入分液漏斗，加入3倍體積水充分搖勻混合，飽和過夜的萃取溶劑與之充分混合，避光萃取12 h，棄去萃取溶劑層，收集、合并水層并濃縮，即得黑枸杞花色苷萃取純化液。

2.3萃取除雜工藝優(yōu)化

2.3.1萃取除雜溶劑種類考察 分別用石油醚和乙酸乙酯避光萃取12 h，收集有機相層進行紫外-可見光全波長掃描(190～800 nm)。

2.3.2萃取次數(shù)考察 用乙酸乙酯避光萃取4次，分別收集水層和乙酸乙酯層，取水層與新鮮的乙酸乙酯混合，進行下1次萃取，取乙酸乙酯層進行紫外-可見光全波長掃描(190～800 nm)。

2.4大孔吸附樹脂純化工藝取適量、一定濃度的黑枸杞花色苷萃取液，在室溫條件下，以一定的流速上樣Amberlite XAD-7HP型大孔吸附樹脂柱(柱徑×柱長：1.0 cm × 15.0 cm)，收集流出液；再使用適量的1%甲酸，以1 mL·min-1的流速充分洗滌樹脂柱，收集洗滌液；然后，以含1%甲酸的一定濃度的乙醇(V/V)為洗脫劑，以1 mL·min-1的流速洗脫樹脂柱，直至洗脫液呈無色，收集洗脫液。

2.5大孔吸附樹脂分離工藝優(yōu)化

2.5.1上樣濃度 取藥材濃度為20、40、100、200 g·L-1的黑枸杞花色苷萃取液，以1 mL·min-1的流速上樣大孔吸附樹脂柱10 mL，每個柱床體積(bed volume,BV，10 mL)收集1次流出液，測定流出液中的總花色苷含量，以流出液中累積總花色苷含量達到上樣樣品總花色苷含量的10%，作為泄漏臨界點而停止上樣。

2.5.2上樣流速 選擇上樣藥材濃度為200 g·L-1，分別以0.5、1、2 mL·min-1的流速上樣大孔吸附樹脂柱，每0.5個 BV 收集1次流出液，測定其中的總花色苷含量，直到出現(xiàn)泄漏臨界點時停止上樣。

2.5.3洗滌液用量 選擇上樣藥材濃度為200 g·L-1，以1 mL·min-1的流速上樣大孔吸附樹脂柱30 mL。以1%甲酸溶液作為洗滌液，按1 mL·min-1的流速洗滌大孔吸附樹脂柱，每個BV收1次洗滌液，采用苯酚硫酸法測定其中的總糖含量。

2.5.4洗脫劑種類 采用“2.5.3”所述條件上樣大孔吸附樹脂柱，再使用1%甲酸溶液洗滌大孔吸附樹脂柱10個BV，將雜質(zhì)除去后。分別采用含1%甲酸的70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮(V/V)，以 1 mL·min-1的流速洗脫樹脂柱，直至洗脫液呈無色，每0.5個BV收集1次洗脫液，測定洗脫液中的總花色苷含量，計算解吸率。

2.5.5洗脫劑濃度 分別采用含1%甲酸的30%、50%、70%、90 %乙醇(V/V)，以 1 mL·min-1的流速洗脫大孔吸附樹脂柱，直至洗脫液呈無色，每0.5個BV 收集1次洗脫液，計算解吸率。

2.5.6洗脫劑pH 分別以含8%甲酸的70%乙醇(pH=2)，含1%甲酸的70%乙醇(pH=3)，含0.05%甲酸的70%乙醇(pH=4)和70%乙醇(pH=5)作為洗脫劑(V/V)，以 1 mL·min-1的流速洗脫大孔吸附樹脂柱，直至洗脫液呈無色，每0.5個BV 收集1次洗脫液，計算解吸率(n=3)。

2.5.7洗脫流速 以70%乙醇(V/V)作為洗脫劑，分別采用0.5、1、2、4 mL·min-1的流速洗脫大孔吸附樹脂柱，直至洗脫液呈無色，每0.5個BV 收集1次洗脫液，計算解吸率(n=3)。

2.6總花色苷含量測定方法參考文獻[8]，采用pH示差法測定提取純化樣品中的總花色苷含量。具體方法為：吸取0.2 mL樣品溶液，分別加入到3.8 mL氯化鉀溶液(0.025 mol·L-1，pH 1.0)與3.8 mL醋酸鈉緩沖液(0.4 mol·L-1，pH 4.5)中，于室溫環(huán)境下避光孵育1 h，獲得pH 1.0和pH 4.5供試品溶液。分別于530 nm和700 nm測定2種供試品溶液的吸光值，并按照以下經(jīng)驗公式計算總花色苷(total anthocyanins content,TAC)含量：TAC (mg/100 g DW)=(A×MW×DF×103/ε×1) ×V×100/m。上述公式中，A(吸光值計算結(jié)果)=(A530 nm-A700 nm)pH 1.0-(A530 nm-A700 nm)pH 4.5；MW(分子量)=449.2 g·mol-1；DF(稀釋因子)=4.0 mL/0.2 mL=20；ε(摩爾消光系數(shù))=26 900 L·mol-1cm-1；l(比色皿光徑長度)=1 cm；DW：樣品干重。

2.7提取純化產(chǎn)物的高效液相色譜分析

2.7.1樣品處理 分別將黑枸杞花色苷提取液、萃取液和大孔吸附樹脂洗脫液濃縮至干，-80℃預凍12 h后，冷凍干燥至恒重。分別稱取一定量的凍干浸膏或粉末，配制成1 g·L-1的供試品溶液，0.22 μm水相濾膜濾過，取續(xù)濾液，避光備用。

2.7.2色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)，流動相為0.5%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫0～10 min，5%～12% B，10～30 min，12%～20% B，30～40 min，20%-50% B，40～45 min，50%～5% B，45～50 min，5% B，柱溫為30 ℃，流速為1 mL·min-1，二極管陣列檢測器(DAD)檢測，檢測波長為530 nm，進樣量為10 μL。

2.8提取純化產(chǎn)物的抗氧化活性評價

2.8.1DPPH自由基清除能力測定 取30 μL樣品或作為空白對照的純水，與2 mL DPPH·甲醇溶液充分混合，40℃黑暗中孵育40 min，得供試品溶液；使用紫外分光光度計于512 nm處測定各吸光值；采用下式計算其DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=[Ac - (Ai - Aj)]/Ac×100%。式中，Ac：空白對照吸光值；Ai：供試品溶液吸光值；Aj：不添加DPPH·的供試品溶液吸光值。稱取適量沒食子酸(gallic acid,GA)于棕色量瓶中，用純水配制成0.1、0.5、1、2、3、4、5 mmol·L-1的GA溶液。按上述方法分別測定各濃度GA稀釋液的DPPH自由基清除率，繪制標準曲線，擬合回歸方程，并將各樣品的DPPH自由基清除率代入上述回歸方程，即得各樣品的GA當量濃度。

2.8.2ABTS陽離子自由基清除能力測定 配制完ABTS·+工作液；取15 μL樣品或作為空白對照的甲醇，加入到4 mL ABTS·+工作液中，避光反應(yīng)40 min；用分光光度計測定734 nm處各反應(yīng)液的吸光值；采用下式計算ABTS陽離子自由基清除率：ABTS陽離子自由基清除率=(A0-As)/A0×100%，式中A0和AS分別為加入空白和樣品后反應(yīng)液的吸光度值。按“2.7.1”相同的方法制備標準曲線，擬合回歸方程，并將各樣品的ABTS陽離子自由基清除率代入上述回歸方程，即得各樣品的GA當量濃度。

3 結(jié)果

3.1萃取除雜工藝

3.1.1萃取除雜溶劑種類 由Fig 1可知，用于去除脂溶性雜質(zhì)的石油醚或乙酸乙酯在花色苷的特征吸收波長(530 nm)附近都未見吸收峰，說明2種萃取劑對目標成分花色苷均無影響。同時，石油醚的萃取除雜效果較差，而乙酸乙酯除雜效果明顯，因此，選擇乙酸乙酯作為萃取除雜溶劑。

Fig 1 Full-wavelength scanning spectrum of petroleum ether and ethyl acetate phase

3.1.2萃取次數(shù) 如Fig 2所示，各次萃取后的乙酸乙酯層在花色苷特征吸收波長處均未見吸收峰。同時，隨著乙酸乙酯萃取次數(shù)的增多，其位于紫外光區(qū)的吸收峰值逐漸降低，當連續(xù)萃取4次后，主要吸收峰的響應(yīng)值已下降為第1次萃取的約1/10，繼續(xù)萃取效果已不明顯，由此選擇萃取次數(shù)為4次。

Fig 2 Effect of ethyl acetate extraction times onfull-wavelength scanning spectrum

3.2大孔吸附樹脂分離工藝

3.2.1上樣濃度 Fig 3結(jié)果表明，在達到泄漏臨界點時，雖然上樣濃度200 g·L-1的解吸率(解吸率=濃縮至上樣樣品等體積洗脫液的總花色苷含量/上樣樣品的總花色苷含量×100%，以下同)略低于其他濃度，但吸附量(以總花色苷含量計，以下同)達到(455.17±17.42)mg·100 DW-1，明顯高于其他上樣濃度。為充分發(fā)揮大孔吸附樹脂的純化效率，增大每批次萃取液的上樣量，故選擇上樣藥材濃度為200 g·L-1。

Fig 3 Influence of sample concentration on macroporous

3.2.2上樣流速 Fig 4結(jié)果顯示，流速2 mL·min-1的上樣吸附量明顯低于0.5 和1 mL·min-1，故不適用于上樣。同時，雖然0.5 mL·min-1的吸附量比1 mL·min-1多約20%，但解吸率比后者少10%，說明上樣量流速過低會增加樹脂的死吸附，不僅損耗樣品，而且不利于樹脂再生，且0.5 mL·min-1的上樣時間比1 mL·min-1時間多約1倍，綜合考慮，選擇上樣流速為1 mL·min-1。此外，實驗結(jié)果表明，當以1 mL·min-1的流速上樣35 mL時，已接近泄漏臨界點，為避免樣品損失，故適當減小上樣體積至30 mL。

Fig 4 Influence of flow rates of sample loading on macroporous

3.2.3洗滌液用量 Fig 5結(jié)果表明，當洗滌至第5個BV時，由分光光度計測得的總糖濃度已接近0，但直到第10個BV，洗滌液的苯酚硫酸反應(yīng)才呈現(xiàn)完全的陰性，故選擇洗滌劑用量為10個BV，即100 mL。

Fig 5 The Washing curve of macroporous adsorption resin

3.2.4洗脫劑種類 3種洗脫劑的解吸率依次為(67.78±8.94)%、(75.43±4.84)%、(61.65±2.05)%，即70%乙醇的解吸率最高。同時，乙醇相對于其他2種洗脫劑的毒性小，且容易去除，故選擇乙醇溶液作為洗脫劑。

3.2.5洗脫劑濃度 4種濃度乙醇洗脫液的解吸率依次為(61.57±0.89)%、(59.96±0.46)%、(75.01±4.24)%、(50.62±5.90)%。由此可知，70%乙醇的解吸能力較強，故選擇乙醇洗脫劑的濃度為70% 。

3.2.6洗脫劑pH 不同pH乙醇洗脫劑的解吸率依次為(77.09±0.99)%、(71.46±0.91)%、(73.95±6.28)%、(73.15±6.12)% ，彼此間的解吸率相差不大，差異無顯著性。同時，考慮到甲酸存在一定毒性，故選擇不含甲酸的70%乙醇作為洗脫劑。

3.2.7洗脫流速 不同洗脫流速的解吸率依次為(63.41±1.61)%、(75.79±0.51)%、(74.85±3.07)%、(73.20±1.53)% ，除流速0.5 mL·min-1的解吸率明顯低于其他流速外，流速為1、2、4 mL·min-1的解吸率相差不大。同時，考慮到洗脫流速越快，雖然洗脫時間越短，但洗脫劑消耗量越大，如1 mL·min-1需要使用18個BV的洗脫液，而4 mL·min-1則需要使用30個BV的洗脫液，故選擇1 mL·min-1作為洗脫流速，從而在保證洗脫效果的同時，減少洗脫劑的消耗。

3.3HPLC分析結(jié)果由Fig 6的HPLC譜圖可知，相同質(zhì)量濃度的黑枸杞花色苷的提取產(chǎn)物(A)、萃取產(chǎn)物(B)和大孔吸附樹脂分離產(chǎn)物(C)在15～35 min內(nèi)均出現(xiàn)7個色譜峰，且各峰的保留時間基本一致，提示經(jīng)純化后，黑枸杞花色苷提取液中的目標成分未發(fā)生改變或丟失。其次，經(jīng)萃取后，各色譜峰峰面積的變化不大，但經(jīng)大孔吸附樹脂分離后，7個色譜峰的峰面積均明顯增加，其中2個主成分峰(峰5和峰1)峰面積比萃取液中的分別增加了10.8倍和9.4倍，說明經(jīng)大孔吸附樹脂純化后，花色苷類成分的純度明顯提高。

Fig 6 HPLC profiles of anthocyanin extracts and purified products

A:Extraction product(1 g·L-1); B:Extraction product(1 g·L-1); C:Macroporous adsorption resin separation product(1 g·L-1).

3.4提取純化產(chǎn)物的抗氧化活性評價

3.4.1DPPH自由基清除能力測定 GA標準曲線的回歸方程為Y(DPPH·清除率)=0.218X(GA當量濃度)+0.0627，R2= 0.992，線性范圍為0.1～4.0 mmol·L-1。1 g·L-1黑枸杞花色苷提取產(chǎn)物、萃取產(chǎn)物和大孔吸附樹脂分離產(chǎn)物的GA當量濃度依次為0.219、0.266、0.770 mmol·L-1。由此可見，純化產(chǎn)物由DPPH自由基清除能力表征的抗氧化活性不斷提高。

3.4.2ABTS陽離子自由基清除能力測定 結(jié)果表明，GA標準曲線的回歸方程為Y(ABTS·+清除率)=0.3503X(GA當量濃度)+0.0068，R2=0.990，線性范圍為0.01～0.5 mmol·L-1。1 g·L-1黑枸杞花色苷提取產(chǎn)物、萃取產(chǎn)物和大孔吸附樹脂分離產(chǎn)物的GA當量濃度依次為0.013、0.017、0.472 mmol·L-1。由此可知，純化產(chǎn)物由ABTS陽離子自由基清除能力表征的抗氧化活性不斷增強，這一結(jié)果與“3.4.1”一致。

4 討論

經(jīng)萃取工藝和大孔吸附樹脂分離工藝的優(yōu)化，本文初步建立了黑枸杞花色苷的純化工藝，即采用水飽和過夜3倍體積的乙酸乙酯萃取提取液4次，每次12 h；取30 mL藥材濃度為200 g·L-1的萃取液，以1 mL·min-1的流速上樣大孔吸附樹脂柱，使用1%甲酸溶液洗滌樹脂柱10個BV，采用70%乙醇(V/V)以1 mL·min-1的流速洗脫樹脂柱，直至洗脫液呈無色，收集、合并和濃縮洗脫液，從而獲得黑枸杞花色苷純化產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，通過高效液相色譜分析和自由基清除率測定，分別從產(chǎn)物純度和抗氧化活性的角度評價了純化效果，結(jié)果表明，產(chǎn)物的純度和抗氧化活性均明顯提高。

萃取工藝的優(yōu)化結(jié)果表明，乙酸乙酯的除雜效果明顯優(yōu)于石油醚，這應(yīng)該與提取溶劑為1%甲酸，提取產(chǎn)物主要是水溶性成分，而石油醚是強親脂性有機溶劑有關(guān)。同時，由萃取后萃取溶劑層全波長掃描結(jié)果與文獻報道[9]可知，花色苷水提液中的親脂性雜質(zhì)主要是吸收波長在250-400 nm內(nèi)的游離黃酮類化合物，這類化合物易溶于乙酸乙酯、氯仿、乙醚等中等極性有機溶劑。而目標成分花色苷屬于黃酮苷類化合物，在苷化后水溶性增加，脂溶性降低，一般易溶于水，而難溶或不溶于乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有機溶劑，不會受到乙酸乙酯萃取的影響，故在萃取工藝中選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑，并采用少量多次萃取的策略。

大孔吸附樹脂法是目前常用的花色苷類成分純化方法[10-11]。一方面，大孔吸附樹脂對花色苷類物質(zhì)具有良好的吸附作用，不僅吸附快，而且吸附量大；另一方面，在吸附后，通過簡單水洗即能有效去除花色苷提取物中的糖類、無機鹽類等水溶性雜質(zhì)，且解吸效率高[12-13]。Amberlite XAD-7HP型大孔吸附樹脂是一種以聚甲基丙烯酸酯為骨架的大孔吸附樹脂，孔徑一般為20～60目，比表面積大，化學穩(wěn)定性高、機械強度好、耐高壓和高溫。且XAD-7HP 屬于中等極性的吸附劑，相比其他柱層析，如凝膠排阻、硅膠吸附、離子交換樹脂層析等，特別適合從天然植物中分離花色苷這樣極性適中的多酚黃酮苷類化合物。因此，本文選擇Amberlite XAD-7HP型大孔吸附樹脂用于黑枸杞花色苷萃取液的純化。經(jīng)上樣、洗滌和洗脫3個階段不同工藝參數(shù)的優(yōu)化，有效去除了萃取液中的糖類等親水性雜質(zhì)，純化產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥后，能夠獲得干燥疏松的粉末，且不易吸潮，便于后續(xù)的純化和定量分析。同時，產(chǎn)物的純度明顯提高，2個主成分的HPLC色譜峰峰面積比萃取液中的增加了10.8倍和9.4倍。此外，產(chǎn)物的抗氧化活性也明顯增加，DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率分別達到相同濃度萃取液的2.9倍和27.8倍。

綜上所述，本研究建立的黑枸杞花色苷純化工藝操作簡便，技術(shù)路線合理，易于放大，明顯提高了產(chǎn)物的純度和抗氧化活性，從而為黑枸杞花色苷的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

(致謝：衷心感謝藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所的張弦老師在實驗中給予的指導和幫助！)