基于ROS/TXNIP/Nlrp3探討蘆薈大黃素對P.g-LPS誘導的小鼠牙周膜成纖維細胞的影響1

戴臨風，謝兆玉，金佳琪，賴潔青，連大衛(wèi)，黃琳硯，黃 怡3,，陳 揚

(1. 廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006；2. 廣州中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510006；3. 暨南大學附屬第一醫(yī)院口腔醫(yī)療中心，廣東 廣州 510630；4.暨南大學口腔醫(yī)學院， 廣東 廣州 510630)

1 背景

牙周炎是非特異性的慢性感染性疾病,牙頸部及齦溝內(nèi)牙菌斑中的微生物是其主要感染源,是常見的口腔慢性疾病，也是牙齒非正常脫落的重要原因，嚴重威脅著我國居民的口腔健康。根據(jù)衛(wèi)計委2017年第四次全國口腔健康流行病學調(diào)查報告顯示在35～44歲居民中，口腔內(nèi)牙石檢出率為96.7%，與10年前持平；牙齦出血檢出率為87.4%比十年前上升了10.1%。牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament fibroblasts, PDLFs)可以對牙周組織進行修復和改建，是牙周膜組織中數(shù)目最大、最主要的細胞類型，對牙周炎發(fā)展過程具有重要作用[1]。牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis,P.g)是牙周炎的主要致病菌，是牙周膜成纖維細胞產(chǎn)生炎癥反應的主要因素[2]。

近代張錫純提出牙疼是因為胃熱上炎，血熱并于牙齦作痛，并伴有牙齦出血潰爛，因此治宜清熱止血；大黃是臨床常用的清熱止血藥，有臨床報告表示在牙周袋局部用大黃治療牙周炎能有效阻斷炎癥的發(fā)展[3]。蘆薈大黃素(aloe-emodin, AE)是大黃重要的蒽醌類有效成分，有較強的抗厭氧菌及抗炎作用，且極佳的抗氧化損傷的作用[4]。但關于AE抗炎機制的研究卻少見報道。因此本研究通過觀察AE對牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Porphyromonasgingivalislipopolysaccharide, P.g-LPS)誘導牙周膜成纖維細胞Nlrp3炎癥小體活化的影響，探討其機制。

2 材料和方法

2.1實驗材料及試劑

2.1.1小鼠牙周膜成纖維細胞(mouse periodontal ligament fibroblasts, mPDLFs)購自武漢Procell公司，貨號：CP-M199。

2.1.2P.g-LPS(tlrl-pglps)、AE(A7687)購自美國sigma公司。

2.1.30.25%胰酶(25200056)、DMEM培養(yǎng)基(11995065)、胎牛血清(FBS) (16140071)購自美國Gibco公司；ROS試劑盒購自中國南京建成生物研究所(E004)；蛋白酶抑制劑(Cocktail)購自美國sigma公司；RIPA Buffer購自美國Millipore公司；脫脂牛奶購自美國Becton, Dickinson and Company；BCA試劑盒(P0028)及蛋白上樣緩沖液購自中國碧云天公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；anti-β-actin(BM0627)(1 ∶1 000)購自中國BOSTER；anti-caspase-1(sc-514)(8∶5 000)購自美國Santa公司；anti-Nlrp3(15101S)(1∶1 000)、anti-TXNIP(14715S)(1∶1 000)、anti-rabbit IgG(7074S)(1∶1 500)、anti-mouse IgG(4408S)(3∶5 000)購自美國CST公司；PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNAEeaser(RR047A)購自TaKaRa公司；RNAiso Plus、SYBR GREEN(RR820A)購自日本TaKaRa公司。

2.1.4化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(TANON 5200)購自中國TANON公司；實時定量熒光PCR儀(CFX96 TouchTM)購自美國Bio-rad公司。

2.2細胞培養(yǎng)和給藥小鼠牙周膜成纖維細胞以10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)，每2～3天傳代。將無血清的DMEM將0.25%胰酶稀釋3倍用于消化。P.g-LPS來自牙齦卟啉單胞菌，用培養(yǎng)基溶解并稀釋至2 μg·mL-1作為刺激劑；AE以0.05、0.1、0.3、0.5 μmol·L-1濃度分別給藥，并在上述環(huán)境中培養(yǎng)24 h備用。

2.3活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS) 實驗采用DCFH-DA作為活性氧探針。細胞鋪板后6 h給藥，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗。將DCFH-DA按1 ∶4 000用培養(yǎng)基稀釋后，加入細胞培養(yǎng)板中，37℃孵育30 min，并在熒光顯微鏡下觀察。0.25%胰酶消化細胞后，1 000 r·min-1離心5 min收集細胞，PBS洗兩次，離心收集細胞沉淀物。將收集好的細胞沉淀物用PBS重懸，用熒光酶標儀進行檢測。檢測時激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長525 nm。

2.4Westernblot總蛋白利用RIPA法提取，并用BCA法測總蛋白濃度。加入適量蛋白上樣緩沖液并在100℃中變性5分鐘，隨后4℃保存?zhèn)溆?。利?2% SDS-PAGE凝膠110V恒壓分離，之后110V恒壓轉膜到PVDF膜上。利用5%脫脂牛奶為封閉液，封閉2 h。對應的一抗在室溫下孵育1 h后轉移至4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。最后用Tanon化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)采集圖像，并分析灰度值。每組實驗重復3次。

2.5RNA的提取和實時定量PCR總RNA用RNAiso Plus提取?？俁NA利用UV-Vis測定濃度，A260/A280值均在1.8～2.2范圍內(nèi)。逆轉錄反應用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，依照說明書進行。實時定量PCR用SYBR Green Realtime PCR Master Mix采用兩步法進行反應，第一步 95℃ 30秒，第二步 95℃ 5秒； 60℃ 30秒循環(huán)40次。實驗利用Real-Time PCR儀進行，反應重復三次。引物序列如下： 小鼠Nlrp3基因：5′-ATTRACCRCGCRCCGRAGARAAGRG-3′ (forward primer)，5′- TCGRCAGRCAARAGARTCCRACARCAG -3′ (reverse primer)； 小鼠caspase-1基因：5′-GAGCTGATGTTGACCTCAGAG-3′ (forward primer)，5′- CTGTCAGAAGTCTTGTGCTCTG -3′ (reverse primer)； 內(nèi)參基因為β-actin：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′(forward primer)，5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′ (reverse primer)。

3 結果

3.1AE對mPDLFs產(chǎn)生ROS能力及硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interactingprotein，TXNIP)表達量的影響如圖1所示，P.g-LPS刺激mPDLFs 24 h后，ROS的產(chǎn)生量明顯高于空白對照組。在使用AE治療后，ROS的產(chǎn)生被抑制，并在0.5 μmol·L-1時降到最低，與模型組相比，有統(tǒng)計學差異。P.g-LPS使小鼠牙周膜成纖維細胞中TXNIP的表達明顯增高。在給予AE后，TXNIP的表達有下降的趨勢，當AE的劑量在0.5 μmol·L-1時與模型組有統(tǒng)計學差異。

3.2AE對P.g-LPS誘導mPDLFs中Nlrp3表達量影響P.g-LPS使mPDLFs中Nlrp3的轉錄水平明顯高于空白對照組。給予AE后，隨著AE劑量的增加，其轉錄水平隨之降低。在WB實驗中，模型組的Nlrp3的表達量明顯高于空白對照組，給予不同濃度AE后也隨之下降。AE對Nlrp3的轉錄與表達的阻斷自最小劑量開始與模型組有統(tǒng)計學差異。

3.3AE對P.g-LPS誘導mPDLFs中前體caspase-1(pro-caspase-1)轉錄與表達及活化caspase-1(cle-caspase-1)表達的影響模型組的前體caspase-1的轉錄水平明顯高于空白對照組，給予AE后，隨著AE劑量的增加，其轉錄水平隨之降低。同時，模型組的前體caspase-1的蛋白表達量及相應的活化caspase-1均明顯高于空白對照組，給予不同濃度AE后均隨之下降。前體caspase-1的轉錄水平與蛋白表達量均當AE在0.5 μmol·L-1時與模型組有統(tǒng)計學差異。與前體caspase-1相似，P.g-LPS令mPDLFs大量表達活化caspase-1，當給予AE治療后其表達量下降，并自0.3 μmol·L-1的劑量開始與模型組有統(tǒng)計學差異。

4 討論

本研究證明AE對P.g-LPS引起的牙周膜成纖維細胞損傷具有保護作用，其作用是通過抑制P.g-LPS引起的牙周膜成纖維細胞ROS-TXNIP通路活化，減緩Nlrp3-inflammasome組成蛋白的聚集及活化程度實現(xiàn)的，除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)AE的保護作用具有濃度依賴性的變化。

在近年來的研究中發(fā)現(xiàn)，牙周炎作為一種頑固性的慢性病變，它的發(fā)生發(fā)展與Nlrp3-inflammasome關系密切，其重要原因是Nlrp3-inflammasome被認為是慢性疾病的中心致病環(huán)節(jié)[5-6]。Nlrp3-inflammasome可以調(diào)控細胞焦亡[7]、破壞細胞骨架[8]、影響細胞功能蛋白的合成、代謝或分泌[9]等細胞功能和活力。Nlrp3-inflammasome，由三部分構成：Nlrp3蛋白與銜接蛋白——ASC及細胞凋亡蛋白酶前體(pro-caspase-1)[10]。研究指出，P.g作為導致牙周炎的主要病原體，其分泌的P.g-LPS可以通過刺激巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等分泌IL-1，IL-6，IL-8，TNF和前列腺素E等多種炎性介子導致牙周結締組織的破壞和牙槽骨的吸收[2]。而某些特定的炎性介質(zhì)如IL-1與Inflammasome關系密切。由上不難看出，Nlrp3炎癥小體通路是抗炎藥物發(fā)揮藥效的潛在靶點[5]，因此在本研究中，將AE的抗炎作用是否與Nlrp3炎癥小體關聯(lián)作為研究重點?；罨痗aspase-1來自于活化的Nlrp3-inflammasome對前體caspase-1的剪切，是Nlrp3-inflammasome最終發(fā)揮病理生理活性的重要“效應器”[11]；它的生成使IL-1β、IL-18等炎性介質(zhì)大量釋放，最終導致細胞功能紊亂，造成細胞的損傷，因而阻斷活化caspase-1的生成是AE抑制Nlrp3-inflammasome活性的關鍵標志。本實驗證明活化caspase-1的活化程度的減弱與AE劑量呈依賴性關系，這一現(xiàn)象反映了AE可以降低Nlrp3-inflammasome的聚集及活化。為了探究AE抑制Nlrp3-inflammasome活化的機制，我們首先檢測了Nlrp3及前體caspase-1的基因與蛋白表達，0.05至0.5μmol·L-1的AE均可以明顯的降低Nlrp3的基因和蛋白表達，然而僅在AE最大劑量(0.5 μmol·L-1)時候可以抑制前體caspase-1的基因和蛋白，基于此我們推測AE可能通過抑制核轉錄水平抑制了Nlrp3-inflammasome相關蛋白的表達，阻斷了活化途徑。

同時我們?yōu)榱诉M一步的說明AE抑制Nlrp3-inflammasome聚集及活化的作用通路，我們初步嘗試探究了影響Nlrp3-inflammasome活化的主要應答機制——氧化應激作用。研究指出，抗氧化能力的喪失是導致牙周炎的關鍵因素，過量生成的ROS對mPDLFs有明顯的促炎作用，是mPDLFs發(fā)生病理損傷的早期信號，直接導致了后續(xù)的牙周組織的病理損傷并導致附著喪失乃至失牙[11-12]。過量產(chǎn)生的ROS可通過活化多種促炎轉錄因子上調(diào)Nlrp3及其下游蛋白的轉錄水平及蛋白質(zhì)表達量[13]，其中包括NF-κB，這是Nlrp3-inflammasome發(fā)揮作用的關鍵調(diào)控因子[10]。在以往的報道中AE具備重要的抗氧化性[4]，我們的結果也同樣表明P.g-LPS會誘導細胞釋放大量的ROS，而AE表現(xiàn)出清除ROS的作用。同時最近一項研究表明，由于活性氧(ROS)過度累積而被切割分離的TXNIP能與Nlrp3形成聚合物，大幅促進了Nlrp3的聚集，最終形成高度活化的Nlrp3-inflammasome六聚體復合物，具有強大的生理病理活性[14-15]。進而我們繼續(xù)檢測與ROS密切相關的TXNIP表達，其在AE最大劑量(0.5 μmol·L-1)下出現(xiàn)明顯降低的結果，這與AE抑制Nlrp3-inflammasome活化結果遙相呼應。所以我們認為AE可能通過抑制ROS的產(chǎn)生調(diào)節(jié)TXNIP在細胞內(nèi)的釋放從而抑制Nlrp3-inflammasome聚集活化起到防治牙周膜成纖維細胞慢性損傷的作用。

Fig 1 The effect of AE on ROS production and TXNIP expression in mPDLFs induced by P.g-LPS.A and B the effect of AEon ROS production in P.g-LPS-induced mPDLFs. C and D the effect of AE on TXNIP expression in P.g-LPS-induced mPDLFs .

ΔΔP<0.01vscontrol；*P<0.05,**P<0.01vsmodel (P.g-LPS)

Fig 2 The effect of AE on the transcription and expression of Nlrp3 in mPDLFs induced by P.g-LPS.

ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vscontrol；*P<0.05,**P<0.01vsmodel (P.g-LPS)

Fig 3 The effect of AE on the transcription and expression of Pro-caspase-1 andcle-caspase-1 expression in mPDLFs induced by P.g-LPS.

ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vscontrol；*P<0.05,**P<0.01vsmodel (P.g-LPS)

綜上所述，我們認為AE可以減少Nlrp3、前體caspase-1及活化caspase-1的生成而阻斷Nlrp3-inflammasome活化的通路，其是通過抑制ROS-TXNIP介導的Nlrp3-inflammasome的聚集過程實現(xiàn)的。通過此通路共同抑制了P.g-LPS誘導的牙周膜成纖維細胞Nlrp3-inflammasome活化是AE表現(xiàn)出抗早期炎癥的重要機制之一。因此，本研究證明AE在輔助治療牙周炎方面有極大的潛能，并為治療慢性牙周炎提供了新的作用靶點和藥物選擇方向。

(致謝：本實驗在廣州中醫(yī)藥大學中藥學院中藥心血管藥理實驗室完成，非常感謝本課題組全體老師和同學對本實驗的指導和幫助。)