貧營養(yǎng)細(xì)菌固體菌劑發(fā)酵工藝的優(yōu)化

張 娜， 趙 輝， 李雅楠， 馬 甜， 蘇建宇

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021

近年來，由于農(nóng)田大量的開墾、農(nóng)業(yè)高強(qiáng)度的利用、過度放牧及自然災(zāi)害等原因，導(dǎo)致土壤貧瘠化問題越來越普遍，給居民生活、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等帶來嚴(yán)重危害[1-2]。目前主要通過植物、化學(xué)及微生物修復(fù)途徑改良貧瘠土壤，努力恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)的功能已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)之一。從根本上改善貧瘠土壤性狀，微生物改良是最佳的選擇，具有巨大的潛力，但目前尚未得到廣泛的研究及應(yīng)用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，貧瘠環(huán)境中存在對(duì)貧瘠極端環(huán)境具很強(qiáng)適應(yīng)能力的貧營養(yǎng)菌，而對(duì)貧營養(yǎng)菌的研究主要基于水環(huán)境及醫(yī)療衛(wèi)生等方面，關(guān)于對(duì)荒漠化、貧瘠化土壤的改良方面的研究卻鮮見報(bào)道。已有研究表明，貧營養(yǎng)細(xì)菌在干旱貧瘠環(huán)境中能夠很好地生長代謝，具解磷解鉀分泌大量胞外多糖等功能[4-7]，可有效穩(wěn)定表層土壤顆粒，提高土壤肥力，為其他植物及微生物的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)干旱貧瘠土壤的改良具有重要意義[8]。功能微生物已被研制成固體菌劑廣泛應(yīng)用，固體菌劑具生產(chǎn)成本低、環(huán)保、方便快捷等諸多優(yōu)勢(shì)，而芽孢桿菌為其理想菌種資源[9-11]，芽孢具抗逆性強(qiáng)、易于保存與儲(chǔ)藏等優(yōu)勢(shì)。固體菌劑發(fā)酵基質(zhì)一般選擇廉價(jià)且來源廣泛的豆粕、米糠、黃豆餅粉、麩皮及其他微量元素[12-15]。我國每年農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生大量有機(jī)廢棄物，其中經(jīng)焚燒等方式處理浪費(fèi)的有機(jī)養(yǎng)分資源約有6 000萬t，嚴(yán)重污染環(huán)境，利用這些農(nóng)林有機(jī)廢棄物作為固體菌劑發(fā)酵基質(zhì)，不僅可以充分有效地利用有機(jī)養(yǎng)分資源、減少環(huán)境污染，而且可以改善土壤生物活性，提高土壤養(yǎng)分含量[11]，但采用農(nóng)林有機(jī)廢棄物制備貧營養(yǎng)細(xì)菌固體菌劑的研究尚未見報(bào)道。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離保存的1株貧營養(yǎng)細(xì)菌為基礎(chǔ)，結(jié)合粉碎的桑樹枝條及棗樹枝條為主要基質(zhì)，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)對(duì)貧營養(yǎng)細(xì)菌固體菌劑發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化后固體菌劑的養(yǎng)分含量進(jìn)行測(cè)定，為其在生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株，由筆者所在試驗(yàn)室從干旱貧瘠土壤中分離篩選純化，為兼性貧營養(yǎng)細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，產(chǎn)芽孢，命名為P4，具較強(qiáng)的解磷解鉀及產(chǎn)胞外多糖能力，在改良貧瘠土壤中具重要意義。

粉碎的棗樹枝條、桑樹枝條由寧夏回族自治區(qū)靈武市森?？萍奸_發(fā)有限公司提供，過篩后分別混勻裝袋備用。硫酸銨[(NH4)2SO4]、氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)，均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

貧營養(yǎng)菌基本培養(yǎng)基：(NH4)2HPO41 g、KNO31 g、(NH4)2SO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.3 g、NaCl 5 g、MgSO4·7H2O 0.41 g、蒸餾水1 000 mL，pH值約為7.3，121 ℃高壓滅菌30 min。葡萄糖(配制成一定濃度的葡萄糖母液于115 ℃下單獨(dú)滅菌25 min，加入到貧營養(yǎng)菌基本培養(yǎng)基中使葡萄糖濃度為15 mg/L)，固體培養(yǎng)基加入15～20 g/L瓊脂粉。

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：采用NA培養(yǎng)基?；竟腆w發(fā)酵培養(yǎng)基：棗樹枝條60%(桑樹枝條 34.46%)、麩皮5%、NaCI 0.1%、K2HPO4·3H2O 0.1%、MgSO4·7H2O 0.02%、(NH4)2SO41%、CaCl20.01%。

1.3 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)于寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室中完成，試驗(yàn)時(shí)間為2016年6—11月。

1.3.1 P4菌劑的基本發(fā)酵培養(yǎng) 保存的P4菌平板劃線活化菌種，接種環(huán)接種至液體培養(yǎng)基中(葡萄糖濃度為 15 mg/L)，在37 ℃、150 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h，為Ⅰ級(jí)種液；取2 mLⅠ級(jí)種液轉(zhuǎn)接至細(xì)菌基本培養(yǎng)基中(葡萄糖濃度為5 g/L)擴(kuò)大培養(yǎng)48 h，為Ⅱ級(jí)種液，培養(yǎng)后的菌液D600 nm為1.4左右，菌量達(dá)1.81×108CFU/mL左右。

基本固體發(fā)酵培養(yǎng)基中pH值為7.0，料水比(質(zhì)量比)1 ∶1.5 且接種量為15%，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2 d，每間隔12 h扣料1次，使其均勻生長，采用平板菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)P4菌在固體發(fā)酵中的生長情況，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 P4菌劑培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

1.3.2.1 單因素條件篩選試驗(yàn) 分別以麩皮、棗樹枝條、(NH4)2SO4、NaCI、CaCl2、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O添加量為單因素，編號(hào)分別為A、B、C、D、E、F、G。通過測(cè)定固體菌劑中活菌數(shù)及芽孢數(shù)量確定每種因素中較優(yōu)水平。

1.3.2.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上確定正交試驗(yàn)分析的因素與水平，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L27(313)優(yōu)化培養(yǎng)基配方，正交試驗(yàn)的因素水平見表1。以活菌數(shù)為指標(biāo)，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)，為了證實(shí)正交試驗(yàn)分析法的可靠性，在最佳培養(yǎng)基成分配比下對(duì)活菌數(shù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

表1 貧營養(yǎng)細(xì)菌P4菌劑培養(yǎng)基條件的優(yōu)化正交試驗(yàn)的因素水平

1.3.3 P4固體菌劑發(fā)酵條件的優(yōu)化 在正交試驗(yàn)確定培養(yǎng)基組分最優(yōu)組合的基礎(chǔ)上，考察培養(yǎng)基厚度(0.5、1.5、2 cm)、料水比(1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5、1 ∶2)、接種量(1%、5%、10%、15%、20%)及pH值(5、6、7、7.5、8) 4個(gè)培養(yǎng)條件對(duì)活菌數(shù)及芽孢的影響。

1.3.4 P4菌劑中菌數(shù)的測(cè)定 P4菌劑中菌數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法；芽孢數(shù)的測(cè)定：取培養(yǎng)好的固體菌劑，梯度稀釋后于80 ℃恒溫水浴10 min，取出后立即冷卻10 min，涂板培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 固體菌劑養(yǎng)分含量的測(cè)定 全氮、灰分、總有機(jī)物及有機(jī)質(zhì)含量的測(cè)定參照NY 525—2012《有機(jī)肥料》；堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定[16]；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量參考文獻(xiàn)測(cè)定[17]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2010、SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 P4固體菌劑培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析 棗樹枝條中含纖維素、半纖維素及糖分等營養(yǎng)物質(zhì)，固體培養(yǎng)基中添加量優(yōu)勢(shì)較為明顯，圖1顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中棗樹枝條添加量為60%(即桑樹枝條添加量為34.46%)時(shí)，菌數(shù)達(dá)3.98×109CFU/g，與添加量為90%(桑樹枝條4.46%)時(shí)無顯著差異，但芽孢率達(dá)82.91%，顯著優(yōu)于添加量為90%的組分。麩皮為芽孢桿菌菌劑制備中常用的原料，圖2顯示，在5%～10%范圍內(nèi)培養(yǎng)基中菌數(shù)及芽孢率較高，當(dāng)添加量為10%時(shí)，菌數(shù)達(dá)6.50×109CFU/g，芽孢率達(dá) 90.77%，顯著高于其他濃度。K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O參與細(xì)菌細(xì)胞壁的形成[18]，其中鎂離子是微生物生長代謝中必不可少的酶的激活劑，圖3顯示，培養(yǎng)基硫酸鎂添加量為0.10%時(shí)，菌數(shù)達(dá)7.50×109CFU/g，顯著高于其他組分；由圖4可知，K2HPO4·3H2O的添加量為0.5%時(shí)，菌數(shù)達(dá)4.40×109CFU/g，芽孢率達(dá)86.36%，顯著高于其他組合。已有學(xué)者研究表明，吡啶二梭酸鈣是活菌數(shù)形成芽孢的重要組成成分[18-19]，溶液中鈣離子促進(jìn)芽孢的形成，但過量的鈣離子會(huì)與磷酸鹽反應(yīng)生成不溶性沉淀，造成培養(yǎng)液中磷元素的損失，由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基中CaCl2的添加量為0.008%時(shí)，菌數(shù)達(dá)9.34×109CFU/g，芽孢率達(dá)90.94%，顯著高于其他組分。由圖6顯示，(NH4)2SO4添加量為0.5%時(shí)，菌數(shù)達(dá)4.00×109CFU/g，芽孢率達(dá)92.00%，顯著優(yōu)于其他組合。由圖7可知，NaCl添加量為0.06%時(shí)，菌數(shù)達(dá)8.50×109CFU/g，芽孢率達(dá)89.88%，顯著優(yōu)于其他組合。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，棗樹枝條、麩皮、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、CaCl2、(NH4)2SO4、NaCl的添加量分別為60%、10%、0.1%、0.5%、0.008%、0.5%、0.06%。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合適的正交試驗(yàn)(表2)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組分，方差分析見表3。通過正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表結(jié)果顯示，各因素對(duì)菌數(shù)影響程度的順序?yàn)椋篈>B>G>D>F>C>E，H為誤差項(xiàng)。根據(jù)各因素水平對(duì)應(yīng)的平均值k可以推斷，采用方案A1B1C1D3E3F1G2可獲得較高的菌落數(shù)。方差分析表如表3所示：A的P值為0.017，B的P值為0.028，在α=0.05水平上均具有顯著性(P<0.05)，可見培養(yǎng)基中棗樹枝條及麩皮的添加量對(duì)固體菌劑中活菌數(shù)效果影響顯著，而C、D、E、F、G因素不具有顯著性(P>0.05)，最優(yōu)組合為A1B1C1D3E3F1G2，得出結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

正交最優(yōu)組合為A1B1C1D3E3F1G2，即棗樹枝條30%(桑樹枝條64.46%)，麩皮5%，(NH4)2SO40.1%，NaCl0.08%，CaCl20.01%，MgSO4·7H2O0.05%，K2HPO4·3H2O0.5%。正交表中無最優(yōu)項(xiàng)，后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證最優(yōu)組合菌數(shù)及芽孢率分別為3.45×1010CFU/g，芽孢率達(dá)94.45%，優(yōu)于其他組合，驗(yàn)證正交試驗(yàn)的可靠性。

表3 正交試驗(yàn)的方差分析

注：F0.95(2，10)=4.10，F(xiàn)0.99(2，10)=7.56

2.2 固體菌劑培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基厚度對(duì)P4菌數(shù)的影響 由圖8可知， 培養(yǎng)基厚度對(duì)P4菌數(shù)影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基厚度為1.5cm時(shí)培養(yǎng)基P4菌數(shù)及芽孢數(shù)達(dá)到最大，菌數(shù)達(dá)12.5×109CFU/g，芽孢率達(dá)80.00%，顯著優(yōu)于其他培養(yǎng)基厚度。培養(yǎng)基厚度太薄會(huì)加速水分的揮發(fā)，使得菌劑容易缺水，而當(dāng)培養(yǎng)基厚度過厚時(shí)細(xì)菌生長過程中的二氧化碳及氧氣的擴(kuò)散、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的形成、酶的催化等都會(huì)受到阻礙[20]，所以培養(yǎng)基過厚會(huì)影響P4菌的正常生長代謝。綜上所述，最優(yōu)培養(yǎng)基厚度選為1.5cm。

2.2.2 料水比對(duì)P4菌數(shù)的影響 含水量在固體發(fā)酵中會(huì)直接影響到菌體的正常生長、代謝，是一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。圖9所示，隨著培養(yǎng)基中含水量的增加，P4菌數(shù)及芽孢率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，培養(yǎng)基中含水量太少，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)無法很好地溶解，固體基質(zhì)膨脹度太低，菌體正常生長、代謝會(huì)受到抑制。培養(yǎng)基料水比為1 ∶1與1 ∶1.5培養(yǎng)基中的菌數(shù)無顯著差異，為了防止培養(yǎng)后期因水分的蒸發(fā)而使得菌數(shù)下降，選擇料水比為1 ∶1.5時(shí)為宜，菌數(shù)達(dá) 1.2×1010CFU/g，芽孢率達(dá)87.5%，而繼續(xù)增加水分會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)內(nèi)透氣性差，使得氧氣不足，對(duì)菌體生長造成影響。

2.2.3 接種量對(duì)P4菌數(shù)的影響 由圖10可見，當(dāng)菌液接種量在1%～15%時(shí)，P4菌數(shù)及芽孢率隨接種量的增大而上升，當(dāng)接種量為15%時(shí)，菌數(shù)達(dá)8.00×109CFU/g，芽孢率達(dá)87.88%，顯著高于其他組分，但接種量繼續(xù)增大反而不利于菌體的生長。綜上所述，最優(yōu)菌液接種量為15%。

2.2.4pH值對(duì)P4菌數(shù)的影響pH值會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞膜上的電荷，影響其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，合適的pH值會(huì)促進(jìn)菌體的生長及代謝[21]。目前，由于固體發(fā)酵含水量一般較少，相對(duì)于液體發(fā)酵，其pH值難以檢測(cè)，一般選擇調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值。由圖11可見，pH值在5.0～7.0內(nèi)隨著pH值增加，P4菌數(shù)及芽孢率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，固體發(fā)酵最適pH值為7.0，菌數(shù)達(dá)1.5×1010CFU/g，芽孢率達(dá)80.00%，與劉喚明等的研究[22]相符，但當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，菌數(shù)及芽孢率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜上所述，最適pH值為7.0。

2.3 最優(yōu)條件下固體菌劑驗(yàn)證

配制最佳培養(yǎng)基組成，培養(yǎng)條件選擇最優(yōu)，優(yōu)化后的固體菌劑菌數(shù)達(dá)4.5×1010CFU/g，芽孢率達(dá)94.57%，均顯著高于其他組分。

2.4 固體菌劑養(yǎng)分含量的測(cè)定

優(yōu)化后的固體菌劑各養(yǎng)分含量為全氮 (18.30±0.035)g/kg，堿解氮(1.56±0.028)g/kg，灰分(10.45±0.207)%，纖維素(18.54±0.735)%，半纖維素(9.465±0.516)%，木質(zhì)素(18.54±0.735)%，總有機(jī)物達(dá)(89.55±0.207)%。該固體菌劑養(yǎng)分含量均很高，有效改良干旱退化土壤。大部分微生物無法直接分解利用纖維素，半纖維素等營養(yǎng)物質(zhì)，目前已通過從自然界直接篩選、原生質(zhì)體融合育種、誘變育種及基因工程育種等方式獲得了多株降解枝條、作物秸稈等的微生物[23]，目前研究最多的為白腐真菌[24]。后期可采用經(jīng)白腐真菌等高效降解菌處理過的粉碎枝條為固體基質(zhì)，提高粉碎枝條的利用率。

3 結(jié)論與討論

諸多研究表明，固體菌劑可有效促進(jìn)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化、釋放及分解，固體菌劑包括不同具解磷解鉀及固氮等功能的細(xì)菌，可有效促進(jìn)作物生長、提高土壤養(yǎng)分[25-26]。采用特殊環(huán)境中的貧營養(yǎng)細(xì)菌改造相應(yīng)惡劣的生態(tài)環(huán)境，是目前一種新型改善土壤荒漠化、貧瘠化途徑[27]，貧營養(yǎng)細(xì)菌長期生存在貧瘠環(huán)境甚至更極端的環(huán)境中，對(duì)外界環(huán)境的變動(dòng)性具強(qiáng)大的快速基因調(diào)控能力。本研究中的貧營養(yǎng)細(xì)菌為兼性貧營養(yǎng)菌，降低生產(chǎn)成本。固體基質(zhì)主要選用粉碎的棗樹枝條和桑樹枝條，不但能有效解決枝條焚燒導(dǎo)致的環(huán)境污染問題，提高產(chǎn)業(yè)附加值，還可為制備固體菌劑提供新型的優(yōu)質(zhì)原料。

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)對(duì)貧營養(yǎng)細(xì)菌固體菌劑發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化后的固體菌劑各養(yǎng)分含量進(jìn)行測(cè)定。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出麩皮，棗樹枝條2個(gè)顯著影響菌體生長的關(guān)鍵因素，固體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基組成為：棗樹枝條30%(桑樹枝條64.46%)，麩皮5%，(NH4)2SO40.1%，NaCl0.08%，CaCl20.01%，MgSO4·7H2O0.05%，K2HPO4·3H2O0.5%。優(yōu)化培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基厚度1.5cm，料水比 1 ∶1.5，接種量15%，pH值7.0。優(yōu)化條件下菌數(shù)達(dá)4.5×1010CFU/g，芽孢率達(dá)94.57%，與其他學(xué)者采用玉米粉、豆餅粉等基質(zhì)優(yōu)化結(jié)果一致。優(yōu)化后的固體菌劑養(yǎng)分含量為：全氮18.30g/kg，堿解氮1.56g/kg，灰分10.45%，纖維素 18.54%，半纖維素9.465%，木質(zhì)素18.54%，總有機(jī)物達(dá) 89.55%。本研究為該菌劑開發(fā)及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。該固體菌劑可對(duì)貧瘠土壤的理化性質(zhì)、持水性有一定的改善，后續(xù)須試驗(yàn)驗(yàn)證固體菌劑對(duì)貧瘠土壤的改良效應(yīng)，此外在工業(yè)化生產(chǎn)中很難達(dá)到實(shí)驗(yàn)室小試效果，今后迫切須要解決如何使工業(yè)化生產(chǎn)達(dá)到小試效果的問題。