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    家蠶δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因Bmoat轉(zhuǎn)錄分析及對免疫的響應(yīng)

    2018-10-13 03:28:50張永紅唐芬芬邵榆嵐白興榮
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年17期
    關(guān)鍵詞:鳥氨酸中腸家蠶

    張永紅, 朱 峰, 唐芬芬, 邵榆嵐, 白興榮

    (云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661101

    家蠶能量代謝過程中,精氨酸在精氨酸酶的作用下水解成鳥氨酸和尿素[1-2],其中δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ornithine-δ-aminotransferase,δ-OAT)作為鳥氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶,對脯氨酸合成起著重要作用[3],而脯氨酸參與機(jī)體的能量代謝[4];家蠶感染BmNPV以后新陳代謝明顯加快,家蠶體內(nèi)能量代謝水平會高于或低于未感染家蠶[5],因此研究Bmoat基因?qū)α私馄鋮⑴c家蠶感染BmNPV后免疫應(yīng)答功能和能量供應(yīng)的一些補(bǔ)償機(jī)制具有重要意義。

    δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶是1種線粒體基質(zhì)酶,它主要在生物機(jī)體合成脯氨酸過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7],其cDNAs從酵母到人的多種物種中得到分離,δ-OAT幾乎在動物各種組織中表達(dá),當(dāng)外界生理刺激侵入機(jī)體時該酶能在特異組織產(chǎn)生應(yīng)答[8]。果蠅δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因與哺乳動物相比具有較高的同源性,其編碼47 ku大小的蛋白,該基因在果蠅的脂肪體內(nèi)高效表達(dá)[9]。在植物擬南芥體內(nèi),δ-OAT蛋白氨基酸序列同樣與酵母、哺乳動物等序列高度同源,在土壤鹽分高濃度脅迫條件下,δ-OAT蛋白活性和oat基因mRNA水平顯著高于正常條件下培養(yǎng)的植株[10],再者轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)過量表達(dá)δ-OAT蛋白能夠增加植株的抗逆性[11]。You等研究發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)基因使小鼠過量表達(dá)δ-OAT蛋白,小鼠在干旱和高滲透壓環(huán)境下抗逆性增強(qiáng)[12]。與哺乳動物相比,關(guān)于昆蟲δ-OAT基因相關(guān)研究較少;δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶參與了家蠶能量代謝,至今鮮有相關(guān)Bmoat基因在免疫應(yīng)答機(jī)理方面的報(bào)道。本研究克隆δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因,對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)及轉(zhuǎn)錄情況分析,并結(jié)合BmNPV侵染明確其表達(dá)規(guī)律對防御BmNPV的免疫應(yīng)答機(jī)制,為探索基因在家蠶免疫方面的功能和防御應(yīng)答模式提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料及主要試劑

    家蠶品種P50和BmNPV,均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所保存。本試驗(yàn)使用病毒濃度為5.27×106/mL。

    MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR相關(guān)試劑、熒光定量SYBR Primix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒,均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;引物、凝膠回收試劑盒及其他化學(xué)試劑,均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 家蠶樣品的采集 家蠶正常條件飼養(yǎng)至5齡3 d,收集家蠶幼蟲頭部、血液、中腸、脂肪體、馬氏管、絲腺、精巢和卵巢組織樣品;在家蠶飼養(yǎng)過程中,收集家蠶蟻蠶至上蔟不同發(fā)育時期個體;在BmNPV處理的試驗(yàn)中,家蠶按常規(guī)方法飼養(yǎng)至5齡起蠶后分為2組,其中試驗(yàn)組每頭蠶添食10 μL BmNPV多角體懸浮液(5.27×106/mL),對照組添食等量的ddH2O。添食后在相同條件下飼養(yǎng)。采集添食BmNPV或ddH2O后3、6、12、24 h家蠶的中腸組織,采集的樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),每個重復(fù)至少取5頭蠶,采集的樣品置于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 家蠶總RNA提取及cDNA合成 家蠶中腸組織用液氮充分研磨,根據(jù)MiniBEST Universal RNA Extraction Kit總RNA提取試劑盒抽提RNA。在紫外分光光度計(jì)上測定組織RNA樣品濃度和純度,保留D260 nm/D280 nm比值在1.8~2.0之間的樣品,按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

    1.2.3 BmOAT序列分析 參照家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(http://silkworm.genomics.org.cn/)設(shè)計(jì)Bmoat的引物(表1)。將提取的家蠶5齡3 d各組織總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。以家蠶脂肪體組織cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);最后72 ℃終延伸10 min。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,利用M13引物擴(kuò)增驗(yàn)證陽性克隆,陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。對BmOAT蛋白的分子量、等電點(diǎn)(http://web.expasy.org/compute_pi/)、信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、功能結(jié)構(gòu)域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和三級結(jié)構(gòu)(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行在線預(yù)測;用GeneDoc軟件對BmOAT與其他物種δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行多序列比對,用MEGA 5.0軟件[13]中的鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)進(jìn)化樹的可靠性)。

    表1 本研究所用引物

    1.2.4Bmoat基因時空轉(zhuǎn)錄情況分析 根據(jù)Bmoat基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR半定量與qRT-PCR熒光定量引物,由表1可知,Bmactin3為內(nèi)參基因,以家蠶5齡3 d幼蟲各組織器官及蟻蠶5齡7 d幼蟲組織器官cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,RT-PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30,72 ℃ 30 s,共31個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。qRT-PCR反應(yīng)儀器為StepOnePlus Real-Time system(Life technologies),參照SYBR Primix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒操作說明配制熒光定量反應(yīng)體系,反應(yīng)體系為 20 μL(SYBR預(yù)混液10 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL,模板1 μL,ddH2O 7.8 μL),反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 30s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù),收集試驗(yàn)組和對照組目的基因與內(nèi)參基因的Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量,其中ΔΔCt=(Ct靶標(biāo)-Ct內(nèi)參)處理-(Ct靶標(biāo)-Ct內(nèi)參)對照。同樣以BmActin3為內(nèi)參基因,家蠶蟻蠶5齡7 d幼蟲各組織器官的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對家蠶整個幼蟲時期目的基因轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析。

    1.2.5 BmNPV感染家蠶5齡幼蟲后Bmoat的轉(zhuǎn)錄分析 設(shè)計(jì)Bmoat的熒光定量PCR引物,由表1可知,在BmNPV處理的試驗(yàn)中,以不同時間段的2組家蠶中腸組織cDNA為模板,Bmactin3為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測,反應(yīng)條件及目的基因相對表達(dá)量的計(jì)算方法同“1.2.4”節(jié)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Bmoat克隆與序列分析

    根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)Bmoat特異性引物,以家蠶5齡3 d中腸組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,目的基因片段經(jīng)過克隆并測序。結(jié)果顯示,BmoatORF全長為1 224 bp,編碼407個氨基酸,信號肽預(yù)測為非分泌型蛋白;通過NCBI Conserved Domain Search在線工具發(fā)現(xiàn),8~402位氨基酸為磷酸吡啶依賴酶(pyridoxal phosphate,PLP)的轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域(Trysin-like serine protease domain)。預(yù)測分子量為 44.7 ku,理論等電點(diǎn)為6.36。利用PSIPRED Server在線軟件預(yù)測BmOAT蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(圖1-A),預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn),BmOAT蛋白由12個α螺旋、14個β折疊和一些無規(guī)則卷曲構(gòu)成;通過SWISS-MODEL同源建模預(yù)測BmOAT蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu),構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)圖(圖1-B),與其二級結(jié)構(gòu)特征一致。

    BmOAT的氨基酸序列(BGIBMGA003564-TA)與NCBI上登錄的其他昆蟲δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行多序列比對。結(jié)果顯示,序列中均含有磷酸吡啶依賴酶的轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域(圖2);其中BmOAT與棉鈴蟲OAT(GenBank登錄號:XM_021337832)序列同源性最高,為84.3%。利用MEGA 5.0軟件,采用鄰接法對上述鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3),進(jìn)化分析結(jié)果顯示,不同物種鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶聚為2支(CladeⅠ和Clade Ⅱ),BmOAT與棉鈴蟲和小菜蛾氨基轉(zhuǎn)移酶在親緣關(guān)系上較近。

    2.2 Bmoat時空轉(zhuǎn)錄情況分析

    通過半定量RT-PCR對Bmoat在5齡3 d各組織的表達(dá)進(jìn)行檢測。組織轉(zhuǎn)錄情況分析發(fā)現(xiàn),Bmoat在家蠶各個組織均有轉(zhuǎn)錄(圖4-A1),以精巢相對表達(dá)量最高(圖4-A2)。對家蠶蟻蠶整個幼蟲時期進(jìn)行表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),Bmoat基因在家蠶整個幼蟲時期持續(xù)性表達(dá)(圖4-B)。

    2.3 BmNPV感染家蠶后Bmoat的轉(zhuǎn)錄分析

    為了檢測Bmoat是否參與家蠶的免疫應(yīng)答,以添食ddH2O的5齡起蠶作為試驗(yàn)組,BmNPV處理的起蠶為試驗(yàn)組,利用實(shí)時熒光定量qRT-PCR(圖4)對Bmoat在中腸的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,與對照組相比,試驗(yàn)組家蠶感染BmNPV 3 h后BmoatmRNA轉(zhuǎn)錄水平開始升高,而感染 6 h 時無明顯變化,至感染12、24 h時開始下調(diào)表達(dá),這說明Bmoat的表達(dá)受病原微生物BmNPV入侵的影響,BmNPV侵染家蠶的第一道屏障是中腸,再結(jié)合其在正常家蠶中Bmoat基因表達(dá)水平,認(rèn)為它在防御BmNPV方面發(fā)揮著重要的作用。

    3 結(jié)論與討論

    δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶是一種線粒體基質(zhì)酶,它主要參與生物機(jī)體能量代謝。本研究成功克隆獲得Bmoat基因(BGIBMGA003564-TA),其基因序列由9個外顯子和8內(nèi)含子組成,編碼區(qū)全長1 224 bp,編碼407個氨基酸,屬非分泌性蛋白,預(yù)測分子量為44.7 ku,等電點(diǎn)為6.36。氨基酸多重序列比對分析結(jié)果表明,BmOAT與棉鈴蟲OAT序列同源性最高(84.3%);而系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示,家蠶與鱗翅目昆蟲棉鈴蟲和小菜蛾轉(zhuǎn)氨酶同聚在CladeⅠ一個分支上。微生物、昆蟲、植物和動物δ-OAT中均含有磷酸吡啶依賴酶PLP的保守結(jié)構(gòu)域[14],BmOAT與鱗翅目昆蟲棉鈴蟲和小菜蛾OAT序列具有高度保守的底物特異性位點(diǎn),因此可利用底物類似物、基因定點(diǎn)突變等方式來預(yù)防農(nóng)林害蟲。

    在對BmOAT蛋白進(jìn)行酶活測定時發(fā)現(xiàn)[15],該蛋白在家蠶5齡期間、羽化后乃至蛹期仍具有較高活力,加之Bmoat基因在家蠶各個組織中均有表達(dá)且整個幼蟲時期呈持續(xù)性表達(dá),說明該基因在家蠶整個生理周期都表達(dá);脂肪體作為昆蟲氨基酸代謝的重要場所,oat基因在雙翅目昆蟲果蠅脂肪體高豐度表達(dá)[9],而Bmoat基因在家蠶的性腺組織高量表達(dá)(圖4-A2),這可能與基因轉(zhuǎn)錄的剪切方式和氨基酸代謝有關(guān),有待近一步驗(yàn)證。

    中腸是家蠶防御BmNPV等病源微生物的重要免疫場所,本研究以家蠶中腸作為探索Bmoat基因是否參與免疫響應(yīng)的對象,家蠶添食BmNPV病毒粒子后,感染組和對照組目的基因熒光定量結(jié)果表明,Bmoat基因轉(zhuǎn)錄水平在家蠶感染BmNPV后發(fā)生明顯變化,在感染3 h時呈上調(diào)趨勢,在家蠶感染BmNPV病毒粒子早期,宿主體內(nèi)病毒數(shù)量較少,BmNPV作為免疫刺激因子誘導(dǎo)了Bmoat基因的表達(dá),家蠶為防御病毒入侵而新陳代謝加快,產(chǎn)生更多能量;而在感染6 h時基因表達(dá)量無明顯變化,感染至12、24 h時均表現(xiàn)出明顯下調(diào),此時隨著BmNPV感染時間的延長,病毒在宿主體內(nèi)大量繁殖,吸收和消耗了大量蠶的養(yǎng)分,使蠶缺乏營養(yǎng),抑制了目的基因的表達(dá),進(jìn)而產(chǎn)生上述的試驗(yàn)結(jié)果。

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