• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    家蠶δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因Bmoat轉(zhuǎn)錄分析及對免疫的響應(yīng)

    2018-10-13 03:28:50張永紅唐芬芬邵榆嵐白興榮
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年17期
    關(guān)鍵詞:鳥氨酸中腸家蠶

    張永紅, 朱 峰, 唐芬芬, 邵榆嵐, 白興榮

    (云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661101

    家蠶能量代謝過程中,精氨酸在精氨酸酶的作用下水解成鳥氨酸和尿素[1-2],其中δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ornithine-δ-aminotransferase,δ-OAT)作為鳥氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶,對脯氨酸合成起著重要作用[3],而脯氨酸參與機(jī)體的能量代謝[4];家蠶感染BmNPV以后新陳代謝明顯加快,家蠶體內(nèi)能量代謝水平會高于或低于未感染家蠶[5],因此研究Bmoat基因?qū)α私馄鋮⑴c家蠶感染BmNPV后免疫應(yīng)答功能和能量供應(yīng)的一些補(bǔ)償機(jī)制具有重要意義。

    δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶是1種線粒體基質(zhì)酶,它主要在生物機(jī)體合成脯氨酸過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7],其cDNAs從酵母到人的多種物種中得到分離,δ-OAT幾乎在動物各種組織中表達(dá),當(dāng)外界生理刺激侵入機(jī)體時該酶能在特異組織產(chǎn)生應(yīng)答[8]。果蠅δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因與哺乳動物相比具有較高的同源性,其編碼47 ku大小的蛋白,該基因在果蠅的脂肪體內(nèi)高效表達(dá)[9]。在植物擬南芥體內(nèi),δ-OAT蛋白氨基酸序列同樣與酵母、哺乳動物等序列高度同源,在土壤鹽分高濃度脅迫條件下,δ-OAT蛋白活性和oat基因mRNA水平顯著高于正常條件下培養(yǎng)的植株[10],再者轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)過量表達(dá)δ-OAT蛋白能夠增加植株的抗逆性[11]。You等研究發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)基因使小鼠過量表達(dá)δ-OAT蛋白,小鼠在干旱和高滲透壓環(huán)境下抗逆性增強(qiáng)[12]。與哺乳動物相比,關(guān)于昆蟲δ-OAT基因相關(guān)研究較少;δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶參與了家蠶能量代謝,至今鮮有相關(guān)Bmoat基因在免疫應(yīng)答機(jī)理方面的報(bào)道。本研究克隆δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因,對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)及轉(zhuǎn)錄情況分析,并結(jié)合BmNPV侵染明確其表達(dá)規(guī)律對防御BmNPV的免疫應(yīng)答機(jī)制,為探索基因在家蠶免疫方面的功能和防御應(yīng)答模式提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料及主要試劑

    家蠶品種P50和BmNPV,均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所保存。本試驗(yàn)使用病毒濃度為5.27×106/mL。

    MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR相關(guān)試劑、熒光定量SYBR Primix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒,均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;引物、凝膠回收試劑盒及其他化學(xué)試劑,均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 家蠶樣品的采集 家蠶正常條件飼養(yǎng)至5齡3 d,收集家蠶幼蟲頭部、血液、中腸、脂肪體、馬氏管、絲腺、精巢和卵巢組織樣品;在家蠶飼養(yǎng)過程中,收集家蠶蟻蠶至上蔟不同發(fā)育時期個體;在BmNPV處理的試驗(yàn)中,家蠶按常規(guī)方法飼養(yǎng)至5齡起蠶后分為2組,其中試驗(yàn)組每頭蠶添食10 μL BmNPV多角體懸浮液(5.27×106/mL),對照組添食等量的ddH2O。添食后在相同條件下飼養(yǎng)。采集添食BmNPV或ddH2O后3、6、12、24 h家蠶的中腸組織,采集的樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),每個重復(fù)至少取5頭蠶,采集的樣品置于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 家蠶總RNA提取及cDNA合成 家蠶中腸組織用液氮充分研磨,根據(jù)MiniBEST Universal RNA Extraction Kit總RNA提取試劑盒抽提RNA。在紫外分光光度計(jì)上測定組織RNA樣品濃度和純度,保留D260 nm/D280 nm比值在1.8~2.0之間的樣品,按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

    1.2.3 BmOAT序列分析 參照家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(http://silkworm.genomics.org.cn/)設(shè)計(jì)Bmoat的引物(表1)。將提取的家蠶5齡3 d各組織總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。以家蠶脂肪體組織cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);最后72 ℃終延伸10 min。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,利用M13引物擴(kuò)增驗(yàn)證陽性克隆,陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。對BmOAT蛋白的分子量、等電點(diǎn)(http://web.expasy.org/compute_pi/)、信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、功能結(jié)構(gòu)域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和三級結(jié)構(gòu)(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行在線預(yù)測;用GeneDoc軟件對BmOAT與其他物種δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行多序列比對,用MEGA 5.0軟件[13]中的鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)進(jìn)化樹的可靠性)。

    表1 本研究所用引物

    1.2.4Bmoat基因時空轉(zhuǎn)錄情況分析 根據(jù)Bmoat基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR半定量與qRT-PCR熒光定量引物,由表1可知,Bmactin3為內(nèi)參基因,以家蠶5齡3 d幼蟲各組織器官及蟻蠶5齡7 d幼蟲組織器官cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,RT-PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30,72 ℃ 30 s,共31個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。qRT-PCR反應(yīng)儀器為StepOnePlus Real-Time system(Life technologies),參照SYBR Primix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒操作說明配制熒光定量反應(yīng)體系,反應(yīng)體系為 20 μL(SYBR預(yù)混液10 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL,模板1 μL,ddH2O 7.8 μL),反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 30s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù),收集試驗(yàn)組和對照組目的基因與內(nèi)參基因的Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量,其中ΔΔCt=(Ct靶標(biāo)-Ct內(nèi)參)處理-(Ct靶標(biāo)-Ct內(nèi)參)對照。同樣以BmActin3為內(nèi)參基因,家蠶蟻蠶5齡7 d幼蟲各組織器官的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對家蠶整個幼蟲時期目的基因轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析。

    1.2.5 BmNPV感染家蠶5齡幼蟲后Bmoat的轉(zhuǎn)錄分析 設(shè)計(jì)Bmoat的熒光定量PCR引物,由表1可知,在BmNPV處理的試驗(yàn)中,以不同時間段的2組家蠶中腸組織cDNA為模板,Bmactin3為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測,反應(yīng)條件及目的基因相對表達(dá)量的計(jì)算方法同“1.2.4”節(jié)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Bmoat克隆與序列分析

    根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)Bmoat特異性引物,以家蠶5齡3 d中腸組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,目的基因片段經(jīng)過克隆并測序。結(jié)果顯示,BmoatORF全長為1 224 bp,編碼407個氨基酸,信號肽預(yù)測為非分泌型蛋白;通過NCBI Conserved Domain Search在線工具發(fā)現(xiàn),8~402位氨基酸為磷酸吡啶依賴酶(pyridoxal phosphate,PLP)的轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域(Trysin-like serine protease domain)。預(yù)測分子量為 44.7 ku,理論等電點(diǎn)為6.36。利用PSIPRED Server在線軟件預(yù)測BmOAT蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(圖1-A),預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn),BmOAT蛋白由12個α螺旋、14個β折疊和一些無規(guī)則卷曲構(gòu)成;通過SWISS-MODEL同源建模預(yù)測BmOAT蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu),構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)圖(圖1-B),與其二級結(jié)構(gòu)特征一致。

    BmOAT的氨基酸序列(BGIBMGA003564-TA)與NCBI上登錄的其他昆蟲δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行多序列比對。結(jié)果顯示,序列中均含有磷酸吡啶依賴酶的轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域(圖2);其中BmOAT與棉鈴蟲OAT(GenBank登錄號:XM_021337832)序列同源性最高,為84.3%。利用MEGA 5.0軟件,采用鄰接法對上述鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3),進(jìn)化分析結(jié)果顯示,不同物種鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶聚為2支(CladeⅠ和Clade Ⅱ),BmOAT與棉鈴蟲和小菜蛾氨基轉(zhuǎn)移酶在親緣關(guān)系上較近。

    2.2 Bmoat時空轉(zhuǎn)錄情況分析

    通過半定量RT-PCR對Bmoat在5齡3 d各組織的表達(dá)進(jìn)行檢測。組織轉(zhuǎn)錄情況分析發(fā)現(xiàn),Bmoat在家蠶各個組織均有轉(zhuǎn)錄(圖4-A1),以精巢相對表達(dá)量最高(圖4-A2)。對家蠶蟻蠶整個幼蟲時期進(jìn)行表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),Bmoat基因在家蠶整個幼蟲時期持續(xù)性表達(dá)(圖4-B)。

    2.3 BmNPV感染家蠶后Bmoat的轉(zhuǎn)錄分析

    為了檢測Bmoat是否參與家蠶的免疫應(yīng)答,以添食ddH2O的5齡起蠶作為試驗(yàn)組,BmNPV處理的起蠶為試驗(yàn)組,利用實(shí)時熒光定量qRT-PCR(圖4)對Bmoat在中腸的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,與對照組相比,試驗(yàn)組家蠶感染BmNPV 3 h后BmoatmRNA轉(zhuǎn)錄水平開始升高,而感染 6 h 時無明顯變化,至感染12、24 h時開始下調(diào)表達(dá),這說明Bmoat的表達(dá)受病原微生物BmNPV入侵的影響,BmNPV侵染家蠶的第一道屏障是中腸,再結(jié)合其在正常家蠶中Bmoat基因表達(dá)水平,認(rèn)為它在防御BmNPV方面發(fā)揮著重要的作用。

    3 結(jié)論與討論

    δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶是一種線粒體基質(zhì)酶,它主要參與生物機(jī)體能量代謝。本研究成功克隆獲得Bmoat基因(BGIBMGA003564-TA),其基因序列由9個外顯子和8內(nèi)含子組成,編碼區(qū)全長1 224 bp,編碼407個氨基酸,屬非分泌性蛋白,預(yù)測分子量為44.7 ku,等電點(diǎn)為6.36。氨基酸多重序列比對分析結(jié)果表明,BmOAT與棉鈴蟲OAT序列同源性最高(84.3%);而系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示,家蠶與鱗翅目昆蟲棉鈴蟲和小菜蛾轉(zhuǎn)氨酶同聚在CladeⅠ一個分支上。微生物、昆蟲、植物和動物δ-OAT中均含有磷酸吡啶依賴酶PLP的保守結(jié)構(gòu)域[14],BmOAT與鱗翅目昆蟲棉鈴蟲和小菜蛾OAT序列具有高度保守的底物特異性位點(diǎn),因此可利用底物類似物、基因定點(diǎn)突變等方式來預(yù)防農(nóng)林害蟲。

    在對BmOAT蛋白進(jìn)行酶活測定時發(fā)現(xiàn)[15],該蛋白在家蠶5齡期間、羽化后乃至蛹期仍具有較高活力,加之Bmoat基因在家蠶各個組織中均有表達(dá)且整個幼蟲時期呈持續(xù)性表達(dá),說明該基因在家蠶整個生理周期都表達(dá);脂肪體作為昆蟲氨基酸代謝的重要場所,oat基因在雙翅目昆蟲果蠅脂肪體高豐度表達(dá)[9],而Bmoat基因在家蠶的性腺組織高量表達(dá)(圖4-A2),這可能與基因轉(zhuǎn)錄的剪切方式和氨基酸代謝有關(guān),有待近一步驗(yàn)證。

    中腸是家蠶防御BmNPV等病源微生物的重要免疫場所,本研究以家蠶中腸作為探索Bmoat基因是否參與免疫響應(yīng)的對象,家蠶添食BmNPV病毒粒子后,感染組和對照組目的基因熒光定量結(jié)果表明,Bmoat基因轉(zhuǎn)錄水平在家蠶感染BmNPV后發(fā)生明顯變化,在感染3 h時呈上調(diào)趨勢,在家蠶感染BmNPV病毒粒子早期,宿主體內(nèi)病毒數(shù)量較少,BmNPV作為免疫刺激因子誘導(dǎo)了Bmoat基因的表達(dá),家蠶為防御病毒入侵而新陳代謝加快,產(chǎn)生更多能量;而在感染6 h時基因表達(dá)量無明顯變化,感染至12、24 h時均表現(xiàn)出明顯下調(diào),此時隨著BmNPV感染時間的延長,病毒在宿主體內(nèi)大量繁殖,吸收和消耗了大量蠶的養(yǎng)分,使蠶缺乏營養(yǎng),抑制了目的基因的表達(dá),進(jìn)而產(chǎn)生上述的試驗(yàn)結(jié)果。

    猜你喜歡
    鳥氨酸中腸家蠶
    家蠶原原種“871”“872”種性變化分析
    抗BmNPV家蠶新品種“川抗1號”的育成
    家蠶猝倒病的發(fā)生與防治
    黃星天牛中腸中內(nèi)切葡聚糖酶的鑒定與酶活性測定
    鳥氨酸苯乙酸對肝硬化患者上消化道出血后血氨水平的影響
    杠柳新苷P和E對粘蟲和小地老虎中腸3種解毒酶的影響
    醒腦靜聯(lián)合門冬氨酸鳥氨酸治療肝性腦病的療效觀察
    浙江省1973年引進(jìn)家蠶品種名
    依氟鳥氨酸治療1例非洲錐蟲病的不良反應(yīng)分析
    大黑鰓金龜消化與解毒相關(guān)基因的組織表達(dá)研究
    欧美激情久久久久久爽电影| 三级国产精品欧美在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 国产黄a三级三级三级人| 丝袜美腿在线中文| 久久99热6这里只有精品| 日韩一区二区视频免费看| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲自偷自拍三级| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲av一区综合| 国产精品一区www在线观看| 国产久久久一区二区三区| 亚洲性久久影院| 亚洲精品亚洲一区二区| 成人特级av手机在线观看| 99久国产av精品国产电影| 欧美高清性xxxxhd video| 伊人久久精品亚洲午夜| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 听说在线观看完整版免费高清| 久99久视频精品免费| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产成人91sexporn| 精品免费久久久久久久清纯| 午夜激情欧美在线| 免费av观看视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产男人的电影天堂91| 午夜爱爱视频在线播放| 看黄色毛片网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 99热这里只有是精品50| 身体一侧抽搐| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 日本欧美国产在线视频| 成人欧美大片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产真实乱freesex| 国内精品久久久久精免费| 精品熟女少妇av免费看| 精品久久国产蜜桃| 亚洲一区高清亚洲精品| 看免费成人av毛片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 嫩草影院新地址| 免费看av在线观看网站| 免费无遮挡裸体视频| 国产一区二区在线观看日韩| av视频在线观看入口| 99久国产av精品| 久久久久久久久久成人| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美激情在线99| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩国内少妇激情av| 国产精品无大码| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产乱人偷精品视频| av天堂中文字幕网| 一区福利在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 国产高清三级在线| 一区二区三区高清视频在线| 国产一区二区激情短视频| 日韩亚洲欧美综合| 久久久欧美国产精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 色综合站精品国产| 久久99热6这里只有精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲七黄色美女视频| 精品日产1卡2卡| 久久久久国产网址| av免费在线看不卡| 国产成人aa在线观看| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品亚洲一区二区| 69av精品久久久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美三级亚洲精品| 有码 亚洲区| 久久精品夜色国产| 国产毛片a区久久久久| 久久亚洲精品不卡| 麻豆国产av国片精品| a级一级毛片免费在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲最大成人av| 久久99热6这里只有精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 美女国产视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 晚上一个人看的免费电影| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 99热这里只有是精品50| av在线观看视频网站免费| 超碰av人人做人人爽久久| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲人与动物交配视频| 黄色配什么色好看| 日韩三级伦理在线观看| 日本黄色片子视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产麻豆成人av免费视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 十八禁国产超污无遮挡网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲内射少妇av| 久久精品国产亚洲网站| h日本视频在线播放| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品一区www在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 日本色播在线视频| 国产亚洲精品久久久com| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品免费久久久久久久清纯| 中文在线观看免费www的网站| 国内精品美女久久久久久| 欧美性猛交黑人性爽| 国产v大片淫在线免费观看| 免费av不卡在线播放| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产视频内射| 亚洲色图av天堂| 国产成年人精品一区二区| 简卡轻食公司| 老熟妇乱子伦视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲av二区三区四区| 五月玫瑰六月丁香| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 成人特级黄色片久久久久久久| 哪里可以看免费的av片| 亚洲av不卡在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品色激情综合| 久久精品夜色国产| 熟女电影av网| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 高清毛片免费看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 深爱激情五月婷婷| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产一区二区在线av高清观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国语自产精品视频在线第100页| 波多野结衣高清作品| 青春草国产在线视频 | 免费大片18禁| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 大型黄色视频在线免费观看| 久久6这里有精品| 亚洲人成网站高清观看| 国产 一区精品| 男女视频在线观看网站免费| 99热精品在线国产| 久久热精品热| 亚洲高清免费不卡视频| 久久久久久久久中文| www日本黄色视频网| 亚洲最大成人手机在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av成人av| 日本在线视频免费播放| 国产极品天堂在线| 久久九九热精品免费| 国产成人一区二区在线| 少妇的逼好多水| 如何舔出高潮| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 免费观看在线日韩| 黄色视频,在线免费观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲欧美成人精品一区二区| 免费av毛片视频| 韩国av在线不卡| 白带黄色成豆腐渣| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日本在线视频免费播放| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜老司机福利剧场| 日韩欧美在线乱码| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产一区二区在线av高清观看| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲成人久久性| 一区二区三区四区激情视频 | 国产黄色小视频在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 尾随美女入室| 国产成人精品婷婷| 中文在线观看免费www的网站| 只有这里有精品99| 国产人妻一区二区三区在| 国产伦精品一区二区三区四那| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品一区www在线观看| 国产毛片a区久久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 在线免费十八禁| 伦理电影大哥的女人| 男女边吃奶边做爰视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产美女午夜福利| 成年女人看的毛片在线观看| 免费搜索国产男女视频| 91狼人影院| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 校园春色视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 午夜激情欧美在线| 悠悠久久av| 好男人视频免费观看在线| 亚洲无线观看免费| 亚洲无线在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| av免费在线看不卡| 亚洲图色成人| 黄片无遮挡物在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美zozozo另类| 午夜视频国产福利| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 级片在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 人妻系列 视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 搡老妇女老女人老熟妇| kizo精华| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久精品国产自在天天线| 久久久久性生活片| 国产爱豆传媒在线观看| 日本欧美国产在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一区二区三区四区激情视频 | 欧美成人a在线观看| 麻豆成人av视频| 床上黄色一级片| 99久久人妻综合| 国产精品福利在线免费观看| 国产人妻一区二区三区在| 九九在线视频观看精品| 亚洲七黄色美女视频| 在线国产一区二区在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品永久免费网站| 一区福利在线观看| 国产91av在线免费观看| 国产一区二区三区av在线 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 最近2019中文字幕mv第一页| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品久久视频播放| h日本视频在线播放| 日本免费a在线| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品,欧美在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲自拍偷在线| av女优亚洲男人天堂| 精品不卡国产一区二区三区| 免费人成视频x8x8入口观看| 不卡视频在线观看欧美| 一级毛片久久久久久久久女| 中文资源天堂在线| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品电影一区二区三区| 国产亚洲91精品色在线| 免费观看精品视频网站| 欧美精品国产亚洲| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 免费观看a级毛片全部| 人妻系列 视频| 中文字幕av成人在线电影| 国产精华一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲七黄色美女视频| 中文资源天堂在线| 欧美一区二区亚洲| 日韩成人伦理影院| 嫩草影院精品99| 亚洲av中文字字幕乱码综合| АⅤ资源中文在线天堂| 成人综合一区亚洲| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产成人a区在线观看| 99久久精品热视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 日本在线视频免费播放| 免费av毛片视频| 亚洲不卡免费看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 秋霞在线观看毛片| 男人舔奶头视频| 国产真实乱freesex| 不卡一级毛片| 99在线视频只有这里精品首页| 免费观看在线日韩| 国产老妇伦熟女老妇高清| 中文亚洲av片在线观看爽| videossex国产| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美激情在线99| 不卡视频在线观看欧美| 日日摸夜夜添夜夜爱| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 级片在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲色图av天堂| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 免费无遮挡裸体视频| av视频在线观看入口| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美性猛交黑人性爽| 免费一级毛片在线播放高清视频| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩欧美在线乱码| 一级毛片久久久久久久久女| 日本熟妇午夜| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲欧美日韩东京热| 超碰av人人做人人爽久久| 91狼人影院| 免费大片18禁| 黄色一级大片看看| 六月丁香七月| 国产老妇女一区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产熟女欧美一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜免费激情av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男人的好看免费观看在线视频| 插逼视频在线观看| 欧美色视频一区免费| 永久网站在线| 国产人妻一区二区三区在| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 最近2019中文字幕mv第一页| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 极品教师在线视频| 久久这里只有精品中国| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久人妻av系列| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲,欧美,日韩| 日本av手机在线免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 夜夜爽天天搞| 免费观看在线日韩| 日韩 亚洲 欧美在线| 此物有八面人人有两片| 干丝袜人妻中文字幕| 日韩中字成人| 国产综合懂色| 国产成人精品婷婷| 亚洲欧美成人精品一区二区| 两个人视频免费观看高清| 欧美不卡视频在线免费观看| 插阴视频在线观看视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲成人久久爱视频| 午夜福利在线在线| 国产精品久久久久久久久免| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 亚洲国产精品合色在线| 美女内射精品一级片tv| 色哟哟哟哟哟哟| 久久精品夜色国产| 免费观看a级毛片全部| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲18禁久久av| 国产精品野战在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 天天一区二区日本电影三级| 一级毛片我不卡| 寂寞人妻少妇视频99o| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品无大码| 免费黄网站久久成人精品| 久久久久久久久大av| 国产色婷婷99| 青春草亚洲视频在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 免费人成视频x8x8入口观看| 永久网站在线| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品成人久久久久久| 精品久久久久久成人av| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 岛国毛片在线播放| 给我免费播放毛片高清在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 丰满的人妻完整版| 国产精品野战在线观看| а√天堂www在线а√下载| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 一级av片app| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产精品,欧美在线| 成人欧美大片| 亚洲七黄色美女视频| 女同久久另类99精品国产91| 在线免费十八禁| 亚洲乱码一区二区免费版| 成年av动漫网址| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人一区二区在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日韩人妻高清精品专区| 免费看日本二区| 日日撸夜夜添| 久久久欧美国产精品| 欧美zozozo另类| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产中年淑女户外野战色| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产高清三级在线| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品.久久久| 禁无遮挡网站| 国产精品福利在线免费观看| 国产乱人偷精品视频| 国产成人福利小说| 看免费成人av毛片| 99久国产av精品国产电影| 国产av在哪里看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 五月玫瑰六月丁香| 欧美激情国产日韩精品一区| 99riav亚洲国产免费| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美极品一区二区三区四区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美日韩国产亚洲二区| 97热精品久久久久久| 午夜福利高清视频| 中文字幕免费在线视频6| 日韩欧美三级三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 精品久久久久久久末码| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产av不卡久久| 日韩国内少妇激情av| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜精品国产一区二区电影 | 直男gayav资源| 亚洲欧洲日产国产| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩中字成人| 99精品在免费线老司机午夜| 日日干狠狠操夜夜爽| 不卡一级毛片| 99久国产av精品| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产日韩欧美在线精品| 精品免费久久久久久久清纯| 国内精品美女久久久久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品免费一区二区三区在线| 97超碰精品成人国产| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲不卡免费看| 色综合站精品国产| 夫妻性生交免费视频一级片| 三级毛片av免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 美女内射精品一级片tv| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 精品人妻一区二区三区麻豆| 最近视频中文字幕2019在线8| .国产精品久久| 能在线免费观看的黄片| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产极品天堂在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产在线男女| 免费搜索国产男女视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 18禁在线播放成人免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品日产1卡2卡| 色哟哟·www| 婷婷精品国产亚洲av| 一级黄片播放器| 国产私拍福利视频在线观看| 日韩成人伦理影院| 久久九九热精品免费| 深夜a级毛片| 亚洲在线自拍视频| 久久6这里有精品| 国产乱人视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 免费大片18禁| 三级国产精品欧美在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| 桃色一区二区三区在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 精品人妻熟女av久视频| 精品国产三级普通话版| 麻豆一二三区av精品| 一级毛片我不卡| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲高清免费不卡视频| 日本与韩国留学比较| 国产色婷婷99| 六月丁香七月| 亚洲乱码一区二区免费版| 国内精品久久久久精免费| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲国产精品国产精品| 久久综合国产亚洲精品| 日韩欧美 国产精品| 色尼玛亚洲综合影院| 免费看美女性在线毛片视频| 两个人的视频大全免费| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩欧美 国产精品| 高清在线视频一区二区三区 | 一本久久精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产精华一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国内精品宾馆在线| 久久亚洲精品不卡| 国产伦在线观看视频一区| 久久久国产成人免费| 99久久精品热视频| 亚洲在久久综合| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久久久久久黄片| 婷婷亚洲欧美| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲18禁久久av| 免费av不卡在线播放|