對(duì)葉紅景天內(nèi)生菌抗病菌株篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

趙 媛， 云 梅， 楊國(guó)柱， 段曉明

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海西寧 810016； 2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016

對(duì)葉紅景天(Rhodiolasubopposita)為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)植物，是多年生草本植物，也是我國(guó)特有的植物，主要分布在青海省、東北地區(qū)、甘肅省、新疆維吾爾自治區(qū)、四川省、西藏自治區(qū)、云南省、貴州省等地[1]，野生資源有限。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天不僅有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗微波輻射、抗菌等顯著功能，還有延緩機(jī)體衰老、防止老年疾病等功能[2]。內(nèi)生菌為能定植在植物組織間隙或細(xì)胞內(nèi)部，并且能與宿主植物建立起共棲、互惠共生、共養(yǎng)等一系列關(guān)系的微生物[3]。作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，植物內(nèi)生菌構(gòu)筑了宿主植物的健康屏障。內(nèi)生菌生物防治植物病害的主要機(jī)制包括分泌抗菌物質(zhì)、競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位及誘導(dǎo)植物抗性等[4]，還可以通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)達(dá)到抗病效果。因此，研究植物內(nèi)生菌，尋找具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物，是研發(fā)新型無(wú)公害農(nóng)藥的重要途徑，前景廣闊。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對(duì)葉紅景天的根、莖、葉及根際土壤采自青海省西寧市大通縣大阪山，經(jīng)青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院張得鈞教授鑒定為景天科紅景天屬對(duì)葉紅景天。

1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 L，pH值自然。

細(xì)菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水 1 L，pH值自然。

放線菌培養(yǎng)基：高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.00 g、KNO31.00 g、KH2PO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂18.00 g、蒸餾水1.00 L，pH值自然。

馬鈴薯葡萄糖液體(PDB)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L，pH值自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g、甘油10.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、K2HPO41.5 g、蒸餾水1.0 L，pH值自然。

碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、K2HPO41.5 g、蒸餾水1.0 L，pH值自然。

氮源發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油10.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、K2HPO41.5 g、蒸餾水1.0 L，pH值為7.3。

1.3 內(nèi)生菌分離

將采集的對(duì)葉紅景天新鮮根、莖、葉用自來(lái)水沖洗多次，然后在無(wú)菌條件下將根、莖切割成0.5 cm×0.5 cm的小塊，葉剪成1 cm×1 cm的小塊，在75%乙醇中潤(rùn)洗1 min后用無(wú)菌水漂洗3次，再用0.1%次氯酸進(jìn)行消毒。根、葉消毒 5 min，莖消毒8 min，再用無(wú)菌水沖洗3次，然后放在已滅菌的濾紙片上，待水吸干后分別接種在加有鏈霉素的PDA培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基及高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng) 3～4 d，待切口邊緣長(zhǎng)出菌絲后，取單菌落轉(zhuǎn)到新的PDA 培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)3次后編號(hào)并接種到試管斜面培養(yǎng) 4～7 d，放入冰箱中4 ℃保存[5-6]。試驗(yàn)中設(shè)立對(duì)照：吸取消毒后最后1次沖洗材料的無(wú)菌水，涂布于各分離平板上培養(yǎng)。若無(wú)雜菌長(zhǎng)出，表明表面消毒徹底，分離到的是內(nèi)生菌[7]?？梢愿鶕?jù)培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出菌落的形態(tài)、顏色、大小等挑取不同的單菌落純化后保存[8]。

1.4 抗病菌株篩選

采用平板對(duì)峙法：用平板劃線法將內(nèi)生菌和病原菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，用滅過(guò)菌的直徑為6 mm的打孔器在病原菌菌落邊緣切取同樣大小的菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板中央，在PDA培養(yǎng)基平板距中心25 mm處用打孔器切去同樣大小的菌餅，并將內(nèi)生菌用無(wú)菌水稀釋后用移液槍接在孔內(nèi)，每個(gè)處理重復(fù)3次。27 ℃培養(yǎng)3 d后測(cè)量抑菌帶的寬度，抑菌帶直徑大于等于10 mm用“+++”表示，抑菌帶直徑大于等于5 mm，小于10 mm用“++”表示，抑菌帶直徑小于5 mm用“+”表示，沒(méi)有抑菌活性用“-”表示[9]。

1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.5.1 種子液制備 選取抑菌活性最好的菌株G5接種于PDA固體培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h；用接種環(huán)挑取單菌落，接入裝有50 mL PDB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，于25 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.5.2 搖瓶培養(yǎng) 取2 mL種子液接入100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中，在30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng) 3 d，將發(fā)酵液在10 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用抑菌圈法進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)，培養(yǎng)3 d后，觀察抑菌效果[10]。

1.5.3 最佳碳源的篩選 碳源發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變，碳源分別設(shè)為1.0%葡萄糖、1.0%乳糖、1.0%果糖、1.0%甘油、1.0%可溶性淀粉、1.0%蔗糖[10]，以碳源發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，接入10% G5菌株種子液，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d；將發(fā)酵液10 000 r/min離心15 min，收集上清液，在PDA培養(yǎng)基平板上涂布上清液，并用滅過(guò)菌的直徑為6 mm的打孔器在病原菌菌落邊緣切取同樣大小的菌餅于PDA培養(yǎng)基平板中央，測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌效果。

1.5.4 最佳氮源的篩選 氮源發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變，氮源分別設(shè)為2.0%蛋白胨、2.0%尿素、2.0%豆粕、2.0%硫酸銨、2.0%大豆蛋白胨、2.0%牛肉膏、2.0%酵母膏[10]；以氮源發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，其他條件相同，抑菌效果測(cè)定方法同“1.5.3”節(jié)。

1.5.5 磷酸鹽對(duì)G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 采用篩選出的最佳碳源和氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)K2HPO4)中分別加入KH2PO4、K2HPO4·3H2O、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸鹽，設(shè)置0.1%、0.2%、0.3%等3個(gè)濃度梯度，以不加K2HPO4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照[10]，基礎(chǔ)發(fā)酵條件培養(yǎng)后，測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌效果。

1.5.6 金屬離子對(duì)G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 采用篩選出的碳源、氮源、磷酸鹽，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)MgSO4·7H2O)中分別加入FeCl3、CuSO4、NaCl、ZnSO4、MgSO4·7H2O、MnSO4、CaCO3、KNO3等溶液，設(shè)置0.1%、0.2%、0.3%等3個(gè)濃度梯度，以不加MgSO4·7H2O的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照[10]，基礎(chǔ)發(fā)酵條件培養(yǎng)后，測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌效果。

1.5.7 優(yōu)化驗(yàn)證 以篩選得到的最佳碳源、最佳氮源、最適磷酸鹽、最適金屬離子作為優(yōu)化培養(yǎng)基。以5%接種量分別接種到優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在25 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 d，將發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心 15 min，收集上清液，測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌效果。試驗(yàn)中以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定其抑菌性。

1.6 G5菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

1.6.1 G5菌株菌落形態(tài)觀察 菌落形態(tài)觀察采用點(diǎn)接法[11]。蘸取少量孢子，在PDA培養(yǎng)基平板中央接植1點(diǎn)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察G5菌落顏色、大小、質(zhì)地、邊緣、生長(zhǎng)速度等特性。

1.6.2 G5菌株顯微鏡觀察 對(duì)G5菌株進(jìn)行顯微鏡觀察，首先對(duì)G5菌株進(jìn)行革蘭氏染色，然后分別在低倍顯微鏡及高倍顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌株的分離

通過(guò)對(duì)對(duì)葉紅景天新鮮根、莖、葉的菌種分離純化，依據(jù)菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征，從對(duì)葉紅景天中初步篩選出24株內(nèi)生菌，其中真菌5株，占20.8%(P1～P5)，細(xì)菌12株，占50.0%(T1～T12)，放線菌7株，占29.2%(G1～G7)。

2.2 對(duì)葉紅景天抗病內(nèi)生菌的篩選

如表1所示，通過(guò)平板對(duì)峙法得出，24株菌株中有12株菌株對(duì)蠶豆莢枯萎病病原菌、菜豆黑斑病病原菌、茄鐮刀菌Ⅰ、茄鐮刀菌Ⅱ均有不同程度的抑菌活性，其中放線菌G5、真菌P1對(duì)茄鐮刀菌Ⅰ有強(qiáng)抑菌活性；放線菌G1、真菌P2、細(xì)菌T11對(duì)菜豆黑斑病病原菌有強(qiáng)抑菌活性；細(xì)菌T3對(duì)茄鐮刀菌Ⅱ有強(qiáng)抑菌性，具體見(jiàn)圖1。選用抑菌活性最好的放線菌G5菌株進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 對(duì)葉紅景天內(nèi)生菌抗病菌株篩選

2.3 內(nèi)生菌培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同碳源對(duì)G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 試驗(yàn)檢測(cè)了葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、乳糖、果糖、蔗糖等6種不同碳源對(duì)內(nèi)生菌抑菌活性的影響。由圖2可知，以乳糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基抑菌效果最好，病原菌菌落直徑為12.25 mm，小于對(duì)照基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的病原菌直徑(21.75 mm)，其次是可溶性淀粉，而葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油等作為碳源時(shí)內(nèi)生菌的抑菌活性較差。因此，選用乳糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

2.3.2 不同氮源對(duì)G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 試驗(yàn)檢測(cè)了牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、豆粕、蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素等作為氮源時(shí)內(nèi)生菌的抑菌活性。由圖3可知，以蛋白胨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基抑菌效果最好，病原菌菌落直徑為11.40 mm，小于對(duì)照基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的病原菌菌落直徑(40.00 mm)，其次是大豆蛋白胨、豆粕，而牛肉膏、硫酸銨等作為氮源時(shí)內(nèi)生菌的抑菌活性較差。因此，選用蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

2.3.3 不同磷酸鹽對(duì)G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 不同磷酸鹽的不同濃度對(duì)G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響如圖4所示，KH2PO4、K2HPO4·3H2O、Na2HPO4·12H2O、Na2HPO4·2H2O 等對(duì)抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生均有不同程度的促進(jìn)或抑制作用，而Na2HPO4·12H2O的3個(gè)不同濃度對(duì)抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生均有較高的促進(jìn)作用，且以濃度為 0.30%時(shí)最為明顯。因此，選擇0.30%Na2HPO4·12H2O為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳磷酸鹽。

2.3.4 不同金屬離子對(duì)G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響 不同金屬離子的不同濃度對(duì)G5菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的影響如圖5所示，F(xiàn)eCl3、CuSO4、NaCl、ZnSO4、MgSO4·7H2O、MnSO4、CaCO3、KNO3等對(duì)抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生均有不同程度的促進(jìn)或抑制作用，而NaCl的3個(gè)不同濃度對(duì)抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生均有較高的促進(jìn)作用，且以濃度為0.30%時(shí)最為明顯。因此，選擇0.30%NaCl為發(fā)酵培養(yǎng)基的金屬離子溶液。

2.4 內(nèi)生菌培養(yǎng)條件優(yōu)化驗(yàn)證

試驗(yàn)測(cè)定了優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)下G5菌株的抑菌效果。由圖6可知，優(yōu)化培養(yǎng)條件下G5菌株的抑菌效果較好，培養(yǎng)至第7天時(shí)其抑菌活性提高了30.06%。

2.5 G5菌株形態(tài)學(xué)鑒定

在顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示，G5菌株為短桿狀，大小為2.81 μm，呈革蘭氏陰性(圖7)。G5菌株菌落形態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生菌的分離及其天然產(chǎn)物的研究已成為世界范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。與不計(jì)其數(shù)的植物附生菌相比，內(nèi)生菌似乎吸引了更多的注意力。主要原因?yàn)橹参飪?nèi)生菌能夠產(chǎn)生豐富多樣的具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物， 其中不少物質(zhì)都具有抑菌活性，在自然界中具有重要的生態(tài)學(xué)作用，因而引起了人們的廣泛關(guān)注并取得了較大進(jìn)展[12-14]。因此，利用我國(guó)的植物內(nèi)生菌資源來(lái)篩選抗菌和殺菌活性物質(zhì)，促進(jìn)新型生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和創(chuàng)新具有十分重要的意義[15]。

表3 G5菌落形態(tài)觀察結(jié)果

對(duì)葉紅景天是青海地區(qū)高海拔珍貴藥用植物，具有抗菌消炎的藥理活性。本研究從青海高山地區(qū)對(duì)葉紅景天中分離出24株內(nèi)生菌，其中有12株具有抑菌活性，進(jìn)一步證明了內(nèi)生菌具有與宿主相似的藥理活性。下一步可對(duì)抗病內(nèi)生菌的有效成分進(jìn)行分離提取，試圖找出使其具有抗病性的某種物質(zhì)。

目前，對(duì)對(duì)葉葉紅景天具有抗病抑菌作用的報(bào)道較少，因此對(duì)于對(duì)葉紅景天的更多有效抑制成分有待進(jìn)一步研究，為對(duì)葉紅景天應(yīng)用于臨床抗菌治療提供充足的科學(xué)依據(jù)。