局部超聲效應(yīng)對甜橙皮渣總酚提取及其抗氧化性的影響

張 震馬亞琴王鵬旭成傳香朱攀攀

(1. 西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2. 國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712)

酚酸很少以游離態(tài)的形式存在，通常與有機酸、糖以及各種酯以結(jié)合態(tài)形式存在，是具有抗癌、抗腫瘤、抗菌、抗氧化性等的一類生物活性物質(zhì)。因此，有效提取酚酸類物質(zhì)是目前的研究熱點。柑橘果實富含酚酸類物質(zhì)，且果皮中酚酸含量高于果肉，柑橘皮中酚酸類物質(zhì)的提取已有不少研究報道。Nayak等[1]比較研究了傳統(tǒng)溶劑提取、加速溶劑提取、微波輔助提取、超聲輔助提取柑橘皮中酚類物質(zhì)。Hiri等[2]在不同的提取條件下研究了微波、超聲、超臨界二氧化碳、高壓等方法處理橙皮對其總酚和單個酚酸組分的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波和微波處理后酚酸提取量最高，由于超聲波在低溫條件下能有效提取熱不穩(wěn)定性組分并保持提取物的品質(zhì)，因此，在未來更具應(yīng)用潛力；超臨界CO2萃取法處理后酚酸提取量最低，但提取過程中有機溶劑的使用量最小，環(huán)保性較好；高壓處理后造成總酚含量的降低，這可能與酶的氧化以及酚酸分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起酚酸降解有關(guān)。Luengo等[3]研究認為應(yīng)用脈沖電場技術(shù)提取甜橙皮渣中的多酚具有潛在的優(yōu)勢，不僅能提高其抗氧化能力，縮短提取時間，而且不使用有機溶劑提取，有利于環(huán)保。

目前，利用局部超聲場對柑橘皮渣總酚和抗氧化性影響的研究尚未見報道。本研究通過劃分超聲水浴槽的空間位置(圖1)，系統(tǒng)地研究水浴槽不同位置產(chǎn)生的空穴效應(yīng)對總酚提取量及其抗氧化性的影響，旨在明確局部超聲場中超聲能量的分布特性，為優(yōu)化超聲提取工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與試劑

甜橙皮渣：原料長葉橙，皮渣來自西南大學(xué)柑桔研究所，50 ℃烘箱烘干，過篩得到80目粒徑的樣品，在4 ℃條件下貯藏備用；

福林酚試劑：北京鼎國試劑公司；

2,4,6-反式-2-吡啶基三嗪 (TPTZ)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸 (Trolox)標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器和設(shè)備

超聲波提取設(shè)備：DP-800型，上海生析超聲設(shè)備有限公司；

電子分析天平：FAZ004B型，上海精密儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 超聲波處理 準(zhǔn)確稱取2 g長葉橙皮渣干樣粉末，置于250 mL三角錐瓶中，按l∶20(g/mL)的料液比加入40 mL 60%乙醇。選定超聲頻率25 kHz的超聲波進行超聲處理，超聲換能器在水槽底部的分布情況見圖2。物料距水槽底部10 cm，超聲波處理過程中水槽水位高度為14 cm，整個試驗水位高度保持一致；此外，設(shè)定的超聲位置與換能器的距離以水槽4個角的頂點和水槽中心點與超聲換能器中心點的距離計算。超聲處理后濾紙過濾并收集濾液放置在-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

(1) 超聲溫度和超聲時間：固定超聲功率800 W，超聲位置 P5，考察在3種超聲溫度(15，30，40 ℃)條件下，超聲時間(10，20，30，45，60 min)對總酚含量和抗氧化能力的影響。

(2) 超聲位置：固定超聲功率 800 W，超聲溫度 30℃，超聲時間 10 min，考察超聲位置(P1，P2，P3，P4，P5見圖1)對總酚含量和抗氧化能力的影響。

(3) 超聲功率：固定超聲溫度30 ℃，超聲位置 P5，超聲時間10 min，考察超聲功率(320，480，640，800 W)對總酚及抗氧化能力的影響。

1.3.3 總酚(TPC)測定 根據(jù)文獻[11]，修改如下：準(zhǔn)確移取0.25 mL提取液于25 mL容量瓶中，加入蒸餾水9.75 mL，再加入0.5 mL福林酚試劑并充分振蕩后靜置5 min，接著加入6%的Na2CO3溶液 5 mL，最后蒸餾水定容至25 mL充分振蕩后避光放置30 min，在760 nm處測定分光光度吸收值。用0.25 mL蒸餾水代替提取液，按上述步驟即得空白。樣品中的總酚含量用每克干物質(zhì)含有的毫克當(dāng)量的沒食子酸含量來表示。

圖1 超聲波設(shè)備示意圖Figure 1 Schematic diagram of the ultrasonic apparatus

圖2 超聲換能器分布圖Figure 2 Schematic diagram of sonochemical reactors for ultrasonic irradiation at 25 kHz

1.3.4 抗氧化性測定 參照FRAP法[12-13]，將0.1 mL提取液與2.45 mL FRAP工作液充分混合，避光反應(yīng)30 min，在593 nm處測定吸收值?？瞻滓?.1 mL 80%甲醇代替提取液與2.45 mL工作液混合均勻，其他步驟同樣品處理，空白校零，抗氧化能力用每克樣品當(dāng)量的Trolox (TEAC)表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測得的試驗數(shù)據(jù)以(x±s)來表示。以Excel和Origin9分析軟件結(jié)合進行分析，方差分析(ANOVA)通過SPSS (Version 20.0.0)完成，P<0.05水平上為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲溫度和提取時間對總酚含量的影響

由圖3可知，超聲溫度和提取時間對長葉橙皮渣中總酚含量的變化有顯著性影響(P<0.05)。不同溫度水平，隨超聲時間的延長，總酚含量的變化表現(xiàn)出不一致性。在溫度為15 ℃時，總酚含量隨超聲時間的增加表現(xiàn)出先減小再增加的趨勢，超聲處理45 min時總酚含量達到最高。在3種溫度條件下，30 ℃處理后總酚含量最高。在40 ℃時，當(dāng)超聲時間從20 min 延長至45 min時總酚含量增加了21.37%，該溫度下總酚含量隨時間的變化差異性最為顯著(P<0.05)。綜上可知，30 ℃超聲處理45 min，總酚含量最高。此外，超聲溫度和提取時間可能存在疊加或互作效應(yīng)，30 ℃時超聲時間從10 min增加到60 min其總酚含量一直呈增加趨勢，但在40 ℃，超聲處理45 min時總酚含量達到最大，之后隨著超聲時間延長總酚含量反而降低。利用超聲波提取咖啡渣中總酚的研究也得到相似的結(jié)果，提取溫度高于45 ℃，提取時間超過36 min總酚含量下降[14]。說明酚酸對高溫敏感，遇熱不穩(wěn)定，在低溫條件下超聲波具有較強的提取優(yōu)勢，表明利用超聲波輔助提取熱不穩(wěn)定性生物活性成分有潛力。另一方面，總酚中的類黃酮物質(zhì)不僅含量比酚酸高而且有較好的熱穩(wěn)定性，超聲處理后，總酚含量可能與類黃酮具有相同的變化趨勢[15]。

2.2 超聲位置對總酚含量的影響

超聲位置作為一個重要的超聲參數(shù)，在以前的文獻中卻鮮有報道，這是因為很多超聲增強的研究并未關(guān)注到超聲場的不均一性。超聲位置對提取效果的影響是基于在超聲場的不同超聲位點其超聲強度不同而產(chǎn)生的。本試驗采用水浴式超聲波，整個水域槽即是超聲場，超聲處理過程中水浴槽內(nèi)水位的高度保持一致。不同超聲位置上，超聲場中的超聲化學(xué)效應(yīng)具有顯著性差異，從P1到P5位置(如圖4所示)，總酚含量呈上升趨勢，P5位置總酚含量最高，說明P5位置可能是超聲槽的活性區(qū)域，該區(qū)域更有利于長葉橙皮渣中酚類物質(zhì)的提取。超聲活性區(qū)域是指具有較強的超聲化學(xué)效應(yīng)(機械效應(yīng)，熱效應(yīng)，空穴效應(yīng))，通常超聲活性區(qū)域與超聲換能器的位置有關(guān)，相關(guān)研究[16]已表明有效的超聲能量存在于超聲換能器附近，并隨中心軸距離的增加而衰減或吸收。

圖3 在P5位置不同溫度水平超聲提取對總酚含量的影響

圖3 Effect of ultrasonic extraction on TPC of extracts from Changye orange peels at temperature level of 15, 30, 40 ℃ with 800 W at the position of P5

圖4 超聲位置對總酚含量的影響

圖4 Effects of local positions on TPC f extracts from sweet orange peels at 30 ℃ with 20 min

2.3 超聲功率對總酚含量的影響

由圖5可知，超聲功率對總酚含量有積極的影響。超聲功率從320 W升高至640 W 時，總酚含量增加了13.12%，增幅較大，可能是超聲功率的增加使局部區(qū)域范圍內(nèi)作用于提取物的超聲化學(xué)效應(yīng)增強。其中超聲波機械效應(yīng)有利于長葉橙皮細胞壁的破壞，使酚類物質(zhì)溶出更多，同時超聲空穴效應(yīng)產(chǎn)生的高溫高壓和強烈的沖擊作用加速了酚酸類物質(zhì)的溶出。此外，超聲波強度越大，熱作用越強，加速了酚酸類等分子的熱運動，總體表現(xiàn)出總酚含量隨超聲波功率的增加而升高。從640 W 升高至800 W時，總酚含量增加了1.86%，增幅變小。隨著超聲功率的增加，超聲處理過程中可能產(chǎn)生的熱損耗和散射能量隨之增加，最終導(dǎo)致作用于組織內(nèi)部的能量相對減少[18]，與前期研究[19]結(jié)論一致。

圖5 超聲功率對總酚含量的影響

圖5 Effects of ultrasonic power on TPC of extracts from sweet orange peels at 30 ℃ with 20 min in position of P5

2.4 局部超聲處理對抗氧化能力的影響

超聲處理對長葉橙皮渣中抗氧化性的影響見圖6。圖6表明提取物的抗氧化性在超聲時間、提取溫度、超聲能量、超聲位置4個超聲參數(shù)的作用下均有顯著變化。比較圖3和圖6(a)，超聲處理對總酚提取及其抗氧化性的影響趨勢非常相似，在相對較低的溫度(15 ℃)條件下，抗氧化能力隨著超聲時間的延長而增加，在相對較高的溫度(40 ℃)條件下，超聲處理45 min后，總酚含量和抗氧化能力均下降，可能是高溫易造成酚酸降解引起的，但總酚的抗氧化能力在低溫條件下超聲處理更有效。當(dāng)超聲能量從320 W增加到800 W時，抗氧化能力增幅達到了13.6%。Singanusong等[20]的研究認為超聲處理能有效地增強柑橘皮提取物抗氧化能力，寬皮柑橘皮提取物抗氧化能力比酸橙高3倍多，丙酮提取物抗氧化能力比甲醇和乙醇都高，并且80%丙酮提取物抗氧化能力最高，測定的FRAP值為2521.47 mg /100 g DW。而超聲處理金諾橘皮得到80%甲醇提取物的抗氧化能力最強，其FRAP值為(42.06±1.11) mg/g[21]。不同研究報道柑橘皮提取物FRAP值的差異很可能是柑橘品種、溶劑類型、溶劑濃度以及超聲設(shè)備型號的不同而造成的。

長葉橙皮總酚抗氧化能力隨超聲位置不同而存在差異，但與總酚影響趨勢基本一致。在超聲槽的P5位置抗氧化能力最強，因此，在超聲提取過程中，選擇有效的超聲區(qū)域有利于從根本上提高提取效率。

2.5 局部超聲場處理后總酚與抗氧化相關(guān)性比較

局部超聲區(qū)域超聲處理長葉橙皮渣總酚含量與其抗氧化能力相關(guān)性見圖7。圖7表明總酚含量與TEAC值有良好的線性關(guān)系?？偡雍吭礁撸鋵?yīng)的抗氧化能力越強。15，30，40 ℃溫度水平(分別超聲10，20，30，45，60 min)，不同超聲位置(P1，P2，P3，P4，P5)和不同超聲功率處理，R2依次是0.708 3，0.746 9，0.718 9，0.971 2，0.735 0，其中不同超聲位置上處理R2最大，說明超聲位置能顯著影響酚酸類物質(zhì)的提取和抗氧化性(P<0.05)。以上結(jié)果表明，總酚含量與其FRAP值存在一定正相關(guān)[22-24]，有效的超聲波處理能顯著提高長葉橙皮酚類物質(zhì)的抗氧化性。

圖6 超聲提取對總酚提取物抗氧化性的影響

圖6 Effects of ultrasonic extraction on antioxidant ability of ethanol extracts from Changye orange peels

圖7 總酚和抗氧化性的相關(guān)性Figure 7 Correlation between TPC and TEAC yield

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明局部超聲效應(yīng)能有效地增強長葉橙皮渣中總酚含量和抗氧化能力。隨著超聲溫度和提取時間的增加，當(dāng)設(shè)定超聲溫度30 ℃，提取時間45 min，超聲槽P5位置及超聲功率800 W時，總酚含量達到最大(8.03 mg/g)。同時，總酚含量與其抗氧化性有良好的線性關(guān)系，在15，30，40 ℃溫度水平，不同超聲位置和不同超聲功率條件下，R2依次是0.708 3，0.746 9，0.718 9，0.971 2，0.735 0，表明局部超聲效應(yīng)顯著影響酚酸等活性物質(zhì)的提取和其抗氧化性?；谏鲜鲈囼灁?shù)據(jù)進一步證實了超聲場的不均一性，明確了超聲換能器的分布是影響超聲能量多寡的主要影響因素。在超聲處理過程中，總酚含量和抗氧化值隨超聲時間和溫度梯度的變化均未與其完全呈直線關(guān)系，而是產(chǎn)生一定波動，可能與局部超聲場的時空動態(tài)變化有關(guān)，其具體時空動態(tài)特性還有待深入研究。